Штамм гриба Aspergillus niger для производства меланина

(12) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Открытое акционерное общество Белмедпрепараты(72) Авторы Царенков Валерий Минович Петров Петр Тимофеевич Скрипко Анна Дмитриевна Дедюшко Наталья Анатольевна Сенчук Вадим Валентинович Курченко Владимир Петрович(73) Патентообладатель Открытое акционерное общество Белмедпрепараты(56)1063834 , 1983.2078810 1, 1997.2080372 1, 1997.2088658 1, 1997.2091485 1, 1997.2103346 1, 1998. Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к производству медицинских препаратов на основе меланина, и касается штамма продуцента меланина. Известен целый ряд культур микроорганизмов, синтезирующих меланиновый пигмент в небольших количествах, -,(Малама А.А. и Касперович Т.В. Изучение пигментов грибови// Микология и фитопатология. - Т. 10. - Ленинград, 1976. - С. 422,),,(Малама , Тернов В.И., Храменко Г.Б., Данильчик Н.И. Влияние меланиновых пигментов, образуемых микроорганизмами, на резистентность мышей к рентгеновскому облучению // Радиобиология. - Т. 12. - М. 1972. - С. 289). Для промышленного производства эти культуры интереса не представляют. Известен меланинообразующий штамм гриба-396 (прототип) (А.с. СССР 1063834 А, МПК 12 15/00 02 3/34 12 1/645, 1983), предложенный авторами для связывания тяжелых металлов при очистке сточных вод. Гриб является аэробом, оптимум роста и спороношения при 25 С, оптимальное значение активности воды равно 0,98, оптимальная кислотность среды рН 4-5, высокоустойчив к тотальным дозам УФ и -излучения, искусственному солнечному свету высокой 5057 1 интенсивности. Гриб усваивает нитратные формы азота, в качестве единственного источника углерода использует глюкозу, сахарозу, крахмал, пектин, целлюлозу, лимонную, щавелевую, уксусную кислоты, обладает целлюлозолитической и тиразиназной активностью. Образующуюся при росте гриба биомассу отделяют фильтрованием от культуральной жидкости и высушивают при 60 С. Выход биомассы гриба составляет 15-20 г/л. Меланиновый пигмент выделяется из биомассы гриба по модифицированному методу путем гидролиза ее немеланиновых компонентов при кипячении в смеси уксусной и соляной кислот. Штамм не находит практического применения, так как имеет невысокую меланинообразующую способность и, являясь аэробом, требует значительных затрат для промышленного культивирования. Задачей изобретения является получение высокопроизводительного штамма продуцента меланина, на основе которого возможно создание технологичного производства субстанции меланина. Эта задача решена за счет создания штаммаБМП-97/2. Штамм получен путем многоступенчатой селекции культуры, выделенной из плесневого налета на стенах бытовых помещений. На основании проведенных исследований микроорганизм отнесен к несовершенным плесневым с непигментированной клеточной стенкой грибам рода. Культурально-морфологические особенности штамма при выращивании на плотных средах при различных температурах представлены в примерах 1-4. Пример 1. Сусло-агар. Агаризованная среда состава агар-агар 20,0 г сусло солодовое 7 Б до 1000 мл. Стерилизация среды 30 мин при 105 С. При культивировании на чашках Петри с сусло-агаром при температуре 28 С штамм образует на 24 ч Колонии белые, пушистые, круглые. Диаметр 1-1,7 см. на 48 ч Колонии складчатые, с бархатистой поверхностью, центр приподнят, темнозеленого цвета, край колоний белый. Конидиальные головки бурого, серочерного цвета. Диаметр колоний 2-2,5 см. на 72 ч Колонии складчатые с мучнистой поверхностью, обильное спороношение. Диаметр колонии более 4 см. Субстратный мицелий светло-желтый. Специфический запах плесени. на 96 ч Колонии черные, крупные, обильное спороношение, обратная сторона колоний светло-желтая. Специфический запах плесени. Пример 2. Состав и приготовление среды в соответствии с примером 1. При культивировании на чашках Петри с сусло-агаром при температуре 37 С штамм образует на 24 ч Колонии белые, пушистые, круглые. Диаметр 0,5 см. на 48 ч Колонии складчатые, центр темно-зеленого цвета приподнят, край колоний белый. Диаметр 0,6-0,8 см. Конидиальные головки в центре бурого и серо-черного цвета. на 72 ч Колонии круглые, складчатые, центр темно-зеленый, край белый. Диаметр колоний 1 см. Конидиальные головки в центре буро-зеленого цвета. на 96 ч Колонии складчатые с мучнистой поверхностью от темно-коричневого до черного цвета, край колоний белый. Диаметр 1,5-2,0 см. Конидиальные головки черного цвета. Специфический запах плесени. 2 5057 1 Пример 3. Среда Чапека. Состав агаризованной среды сахароза 30,0 г 3 2,0 г К 2 НРО 4 1,0 г КС 1 0,5 г 0,5 г 472 0,01 г 472 агар-агар 20,0 г вода дистиллированная до 1,0 л. Стерилизация среды 30 мин при 105 С. При культивировании на чашках Петри со средой Чапека при температуре 28 С штамм образует на 24 ч Роста нет. на 48 ч Колонии белые, круглые. Начало спороношения. на 72 ч Колонии белые, бархатистые, обильное спороношение по всей поверхности. Диаметр колоний 1,5 см. Конидиальные головки коричнево-черного цвета. на 96 ч Колонии складчатые, обильное спороношение. Диаметр колоний 2 см. Конидиальные головки бурого цвета. Специфический запах плесени. Пример 4. Состав и приготовление среды в соответствии с примером 3. При культивировании на чашках Петри со средой Чапека при температуре 37 С штамм образует на 24 ч Роста нет. на 48 ч Колонии точечные, круглые, белого цвета. на 72 ч Колонии белые, круглые, диаметр 0,5 см, конидиальные головки в центре буро-зеленого цвета. на 96 ч Колонии складчатые, круглые, с мучнистой поверхностью, черного цвета. Диаметр 0,8-1 см. Физиолого-биохимические признаки. Штамм .БМП-97/2 - факультативный анаэроб. Способен расти в интервале температур от 18 до 40 С. Оптимальная температура роста культуры - 28 С, биосинтеза меланина - 37 С. Оптимальный рН - 6,50,5. Синтезирует меланин как внутри клеток,так и внеклеточно. Культура ассимилирует большинство сахаров (глюкоза, сахароза, мальтоза, арабиноза). Не усваивает этиловый спирт. Коагулирует и пептонизирует молоко. Разжижает желатину. Обладает протеазной и оксидазной активностью. Культура сохраняет жизнеспособность в виде лиофилизированной споровой суспензии в течение 2 лет. Техническим результатом изобретения явилось получение высокопроизводительного штамма продуцента меланинового пигмента. Изобретение поясняется примером. Пример 5. Изолированную колонию на 96 ч культивирования на чашке Петри с сусло-агаром(пример 1) бактериологической петлей переносят в пробирку со стерильным сусло-агаром и выращивают 14 суток при температуре 281 С. В пробирку с выросшей культурой вносят 10 мл стерильной дистиллированной воды и бактериологической петлей готовят водную суспензию спор, которой засевают 5 пробирок со стерильным сусло-агаром, растят 14 суток при температуре 281 С и готовят водную суспензию спор, как описано выше. 3 5057 1 Суспензией спор засевают 5 колб с ферментационной средой (1 пробирка в 1 колбу). Состав ферментационной среды 1. Сахароза 30 г 2. К 2 НРО 4 0,3 г 3. КН 2 РО 4 0,7 г 4. 4 0,5 г 5. 3 2,0 г 6. КС 1 0,5 г 7. 4 1,0 мг 8. Вода дистиллированная до 1 л. Компоненты растворяют в подогретой воде и доводят объем водой до 1 л. Проверяют рН - должен быть в пределах 7,0-7,1. Приготовленную среду разливают по 200 мл в 5 колб Эрленмейера вместимостью 750 мл и стерилизуют в автоклаве 30 мин при 122 С. Ферментацию ведут в анаэробных условиях при температуре 371 С в течение 20 суток, после чего содержимое пяти колб объединяют, меланин выделяют из культуральной жидкости щелочной экстракцией с последующим солянокислым осаждением. Получают 12 г меланина технического и растворяют его в 40 растворе едкого натра. После хроматографической очистки раствор лиофильно сушат. Получают 8 г фармакопейной субстанции меланина с содержанием основного вещества 91,0 в пересчете на сухое вещество. Продукт жизнедеятельности культурыБМП-97/2 - меланин - может быть использован для производства лекарственных средств. Меланин представляет собой пигмент полифенольной природы, имеющий хиноидные,карбоксильные и другие функциональные группы. Это порошок от коричневого до черного цвета без вкуса и запаха, умеренно растворим в воде, легко растворим в щелочах. Содержание основного вещества в меланине от 87 до 96 в пересчете на сухое вещество. Химическая структура меланина определяет разнообразные химические и биологические свойства и чрезвычайно низкую токсичность, что позволяет использовать препарат в качестве фотопротекторного и антиоксидантного компонента лечебных и профилактических средств, а также для коррекции неблагоприятных эффектов на организм ионизирующего излучения, тяжелых металлов, ряда ксенобиотиков и т.д. Штамм депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов концерна Белбиофарм, регистрационный номер Г-1-9 от 1.09.1999. Культура используется в производстве лекарственных форм на основе меланина на АО Белмедпрепараты. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4