Штамм ацидофильных бактерий Lactobacillus acidophilus Ke-10, используемый для производства кисломолочных продуктов и бактериальных препаратов

(12) ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ ведомство гвспувлики БЕЛАРУСЬЬАСТОВАСТЬЬПЗ АСПЭОРНТЪПЗ КЕ-Ш, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ И БАКТЕРИАЛЬНЬГХ ПРЕПАРАТОВ .(71) Заявитель Институт микробиологии Академии наук Беларуси (В)Штамм ацидофильных бактерий Ъастоъасшиз асшорийшз Ке-10, используемый для производСТВЗ КИСЛОМОЛОЧНЫХ продуктов И бактериальных препаратов. Хранится в коллекции культур непатогенных ьащсрооргапизмов Института микробиологии АНБ, коллекционный номер БИМ-В 85 Д.Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый штамм ацидофильных бактерий, который может быть использован для производства кисломолочных продук тов и бактериальных препаратов.О Известно, что ацидофильные бактерии находят широкое применение в молочной промыш 1-1 леиности при изготовлении кисломолочныхФ продуктов, известно также их использованиеч для производства бакпрепаратов, эффективных при лечении ряда заболеваний.Производственные штаммы ацидофильных бактерий должны обладать свойствами, обес Щ начинающими получение продуктов с высоки(73) Патентообладатель Институт микробио лош Академии наук Беларуси (ВТ)1. Ерзинкян Л.А. Биологические особенности некоторых рас молочнокислых бактерий. Ереван Изд. АН Арм. ССР, 1971 - С. 236.ми органолептическими показателям/н, и способностью подавлять развитие нежелательной,в том числе патогенной микрофлоры. Они должны характеризоваться высокой энергией кислотообразования, антибиотической активностью, устойчивостью к ряду неблагоприятных факторов, способностью гцдролиаовать белки молока с образованием продуктов приятного вкуса и аромата.В молочной промьппленности применяются штаммы ацидофильных бактерий, обладающие предельной кислотностью на уровне 400425 Т 1, Это приводит к снижению органолептических свойств вырабатываемых продук з ВТ 1461 С 1 4ТОВ К МОМВНТУ ИХ рСа-ТИЗЗЦНИ. ИЗВЕСТЕН ТНКЖЕ штаммы ацидофильных бактерий, которые, в основном, соответствуют требованиям, предъЯВЛЯВМЫМ К ПРОИЗВОДСТВЕННЫЕ культурам, НО не превышают последние по уровню антагонистической активности 2. Наиболее близким по свойствам к заявляемому является штамм асюъасгейцш асшоршшш ЫК 1 З 1, обладающий высоким уровнем антагонистической акТЕВНОСТИ ПО ОТНОШЕНИЮ КПЗТОГВННЫХ бактерий (шигелшь Зонне и Флекснера, протеи, сальмонеллы). Однако этот штамм недоСГЕТОЧНО ЗКТЕШВН ПО ОТНОШЕНИЕ К СГЗФИЛОКОККЕМ Н ЭНТЕРОПЗТОГЕННЫЗМ КИШЕЧНЫМ ПЗЛОЧКЗМ,что делает его малоэффективным для лечения кишечных инфекций и дисбактериозов. Задача изобретения - штамм ацидофильных бактерий, отвечающий всем требованиям производства кисломолочных продуктов обладающий высокой энергией кислотообразования,в том числе в первые часы развития в молоке,достаточной устойчивостью к воздействию неблагоприятных факторов среды обитания(желчи, фенолу, поваренной соли), широким СПЕКТРОМ И ВЫСОКИМ УРОВНЕМ ЕНТЗГОНИСТИЧСской активности в отношении. патогенных и условно-патогенных шшроорганизмов. заявляемый штамм Ъастоъасшпз асйаорппцз Ке-10 выделен из модельной двухштаммовой ассоциации после длительного совместного культивирования производственного штаммаЪастоьастегйпш асйборЬЦпш с пищевыми дрож жами в аэробных условиях. Поскольку было установлено, что штаммы с высокой кислотообразующей способностью, как правило, обладают выраженной антагонистической активностью, критерием отбора служил уровень кислотообразования в молоке. Штамм получен путем выделения с поверхности агаризованного гидролизованного молока с мелом колонии,имеющей наибольшую зону просветления. Штамм отличается от исходного и других отобранных вариантов по уровню кислотообразования в молоке, уровню и спектру антагонистической активности.Идентификация штамма проводилась по основным морфологическим, кулътуральным и физиолого-биохимическим признакам. Виловое название принято в соответствии с определителем Вегвеу.заявляемый штамм Ъастоьасшцз ас 1 бор 1111 цв Ке-10 имеет следующие морфологические,культуральные и физиолога-биохимические признаки.Культуральпо-морфологические признаки. Незернистые палочки, гр. Величина клеток 18-чаоовой культуры в молоке 0,9-1,0 х 4-38 мкм. Клетки неподвижные, расположены поодиночке или короткими цепочками, хорошо окрашиваются метиленовым синим. Минимальнаятемпература развития 20 С, оптимальная 3839 С, максимальная б 2 С, летальная 80 С. Гомоферментативный микроаэрофил. Расгет на цельном, обезжиренном, гидролизованном молоке и молочной сыворотке,среде МРЗ, МПБ с добавлением источника усвояемого углерода. На агаре с гидролизованным молоком образует светлые локонообраз ные колонии диаметром 10-1,5 мм. Оптимальный рН развития б,З-6,5. При оптимальной температуре сквашивает цельное молоко до образования сгустка с 1 закваски за 6-7 ч,З-5 ч, 5-4 ч, кислотность через 24 ч 190 Т З сут-310 Т, предельное кислотное образование в молоке - 380 Т.физиолога-биохимические признаки желатин не разжижает, не образует аммиак из аргинина, газ из глюкозы. Сбраживает с образованием молочной кислоты лактозу, глюкозу, галактозу, амилодекстрин, слабо-сахарозу, маннозу. фруктозу, не сбраживает ксилозу, раффинозу, рамнозу, арабинозу, сорбит,дульцит, маннит, инозит, ксшшт.Растет в присутствии 20 желчи, 035 фенола, 4 поваренной соли. Сохраняет активностъ после прогревания при 65 С в течение 90 мин. Устойчив к карбенициллину. Умеренно устойчив к левомшшнзп неомицину,канашщину, тетрациклину, гентамицину, оксациллину, доксицнллину, моношщину, рифампнцину, ристомицииу, пиперациллину,мезлоцштлииу чувствителен к бензилпенициллину, стрептомицину, олеандомицину,линкомицину неомицину. Токсических веществ не продуцирует. Антагонистическая активность в присутствии нейтрализованных бесклеточных фильтратов культуральной жидкости 18-часовой культуры штамма, выращенной в молоке, за 24 ч полностью подавляется рост следующих тест-организмов Зтаройососсцз ацгеп 5,Б 11135 е 11 а Нехпег, 11. зоппее, Рготепв шйгаьшз, Р. шогдапй, К 1 еЬ 51 е 11 а рпецшопйае,ЕптегоЬастег зр., Рзепаошопаэ аегпейпоза, Ре. а 1 со 115 епев, а 1 шопе 11 а туры, 8. туршшйгйцш, 8. рапаша, 3. числом.Антагонистическая активность штамма Ке-10 изучалась путем культивирования тесторганизмов с нейтрализованныьш бесклеточными фильтратами КЖ с целью исключения бактерицидного действия свободной молочной кислоты, продуцируемой культурой. При использовании данной методики бактерицидное действие обеспечивается за счет антибиотических веществ. В пробирки с 1 мл разведенного водой (11) гидролизованного молока вносшш 1 мл фильтрата КЖ в разведениях 12, 14,18, 132 и 1 петлю суспензии тест-культуры,содержащей 500 кл/ мл (по оптическому стандарту мутности). В контрольных образцах 2 мл разведенного гидролизованного молока за 5 ВУ 1461 С 1 всевали 1 петлей суспензии тест-культуры. В качестве тест-организмов ИСПОЛЬЗОВНЛИ ТИПОвые культуры патогенных бактерий из коллекции кафедры эпидемиологии и микробиологии Белорусского института усовершенствования врачей Минздрава РБ (13 штаммов) и бактерии, выделенные от больных в Минской городской инфекционной больнице (17 штаммов). Пробирки с посевами термостатировалн при З 7 С в течение 24 и 48 ч. Рост тест-культур (или его отсутствие) оценивали визуально и путем контрольных высевов на МПА. После 24 ч в опытных образцах из 0,1 мл вырастало от 1 до 30 колоний стафилококков (разведения фильтрата 12 и 132, соответственно) и 10-50 колоний ршигелл(разведение 132), что составляло не более 0,004 от контроля. Остальные образцы оказаштсь стерильными. Полученные данные позволили сделать вывод о высокой антагонистической активности заявляемого штамма.заявляемый штамм соответствует требовании ям, предъявляемым к производственным чистым культурам ацидофильных бактерий он активно снижает рН молока до уровня 3,8-3,9,в том числе в ранние сроки развития, и по кислотообразованию не уступает известным ШТНММЕМ, ПрРП/СНЯЕМЫМ В ПРОИЗБОДСТВ КИС ломолочных продуктов (табл. 1). По спектру и уровню антагонистической активности он имеет несомненные преимущества перед известными штаммами антагонистами, применяемыми при производстве бактериальных препаратов для коррекции бактериоценоэов кишечника (табл. 2). Рост шигелш Флекснера и Зонне, сальмонелл и протея при их совместном культивировании со штаммом Ы К 1 подавляется полностью лишь за 72 ч, в присутствии нейтральных фильтратов КЖ заявляемого штамма - за 24 ч. Особенно значительны преимущества последнею в уровне активности против энтеропатогениьхх кишечных палочек и стафилококков. За 72 ч рост этих бактерий подавляется штаммом Ы К 1 соотвегствентто на 79,3 и 32,4, штаммом Ке-10- полностью за 24 ч. заявляемый шташи обладает по сравнению с известными более широким спектром антагонистической активности за 24 ч полностью подавляет рост клебсиелл,энтеробактера и псевдомонад. Активность против синегнойной палочки (пседомонады) позволяет считать штамм Ке-10 исключительно перспективным не только как средства для коррекции кишечной микрофлоры, но также для санации инфицированных ран.Пример. Выращивание заявляемого штамма Ке-10 в молоке проводят по технологическойинструкции на ацидофильное молоко Наронанка (ТУ 10 РБ 0209-24-92).В стерильное или пастеризованное молоко вносят 3-5 И, закваски, приготовленной в соответствии с инструкцией по приготовлению и использованию закваски для ацидофильные молока Нарочанка (по вышеуказанному ТУ). Заквашенную смесь разливают в стеклянные емкости и выдерживают при 38-39 С до образования сгустка. Продолжительность сквашивания 4-5 ч, кислотность продукта после сквашивания 70 Т. После окончания сквашивания продукт немедленно перемещают в холодильную камеру, где охлаждают до 6-8 С. Ацидофильное молоко, приготовленное на тшстой культуре штамма Ке-Ю, имеет однородную вязкую консистенцию (21 Па. с) вкус и запах чистый, кисломолочный, без примеси посторонних компонентов. Кислотность после охлаждения. не превышает 100 Т. В 1 мл продукта содержится 108-109 клеток. Продукт может быть получен в сухой форме.Высокая антагонистическая активность заявляемого штамма, выявленная 1 п уйго, подтверждается данными клинических испытаний ацидофильного молока, приготовленного на чистой культуре. Испытания проведены на базе Минской городской инфекционной клинической больницы на группе из 92 больных, В том числе 75 - острыми кишечными инфекциями (дизентерия, сальмонеллез, гастроэнтерит, кишечный иерсиниоз), 7 - дисбактериозом кишечника и 10 - сепсисом, подвергавшихся массивной антибактериальной терапии. Все пациенты, за исключегшем бошзных дисбактериозом, получали соответствующее этиотропное лечение. Анализ эффективности ацидофильного молока, проведенный на основании динамики клинико-лабораторных показателей,выявил у 55 И, больных острыми кишечными инфекциями- быструю регрессию основных клинических признаков. У больных дисбактериозом в 100 случаев прием ацидофильного молока способствовал нормализации кишечной микрофлоры, купированию диспептических расстройств и болевого синдрома. У больных сепсисом на фоне массивной антибактериальНОЙ терапии ОТСуТСТВОВа-ЛИ КЛИНИЧВСКИ ПРИЧзнаки дисбактериоза, хотя по микробиологическим показателям наблюдался смешанный дисбактериоз кишечника. После прекращения курса антибиотикотерапии применение ацидофильного молока позволяло в течение месяца полностью восстановить кишечную микрофлору- ЦРезультаты испытаний свидетельствуют о несомненной эффективности препаратов на основе заявляемогоуштамма в комплексной терапии инфекционных болезней и как самостоятельного средства при лечении и профилактике дисбактериозов различной этиологии.Процент клеток тест-кущтур, погибших под воздействием Тест-культуры штамма-антагонистаЭнтеропатогенные Протеи Эшегшшя коли Энтеробактер Сальмонеллы Стафилококки- не определяли данные для разведения фильтрата 12Заказ 1762 Тираж 20 экз. Государственное патентное ведомство Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.