Штамм бактерий Methylobacillus sp. М75, используемый в качестве тест-культуры для определения метанола и метиламина

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ ШТАММ БАКТЕРИЙ. М 75, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-КУЛЬТУРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТАНОЛА И МЕТИЛАМИНА(71) Заявитель Белорусский государственный университет(73) Патентообладатель Белорусский государственный университет(57) Штамм бактерий. М 75, используемый в качестве тест-культуры для определения метанола и метиламина. Хранится в коллекции культур микроорганизмов НИЛ молекулярной генетики бактерий Белорусского государственного университета под номером КМБУ-75.(56) 1. А.с. СССР 1620479, МКИ С 12 1/20, 1991. Изобретение относится к биотехнологии и касается использования нового штамма микроорганизмов в качестве тест-объекта для определения метанола и метиламина в сточных водах различных химических предприятий. Наиболее близким к заявляемому является способ определения метанола с помощью метилотрофного штамма 28 (ВКПМ В-42-18), предназначенного для очистки сточных вод от метанола 1. Недостатком этого штамма является то, что он растет на высоких концентрациях метанола в среде (от 2 об. до 8 об.), что делает невозможным выявление более низких концентраций этого соединения. Кроме того, скорость роста штамма на метаноле невысокая и стационарная фаза культуры наступает только через 72 часа. К числу существенных недостатков штамма 28 можно отнести то, что он не является облигатным по отношению к метанолу и может использовать широкий спектр других углеродсодержащих соединений (этанол, бутанол, изопропанол, глицерин, молочная кислота, щавелевая кислота, янтарная кислота, глюкоза, сахароза, фруктоза, мальтоза, лактоза, галактоза,арабиноза, дульцит, аспарагин, глутамин, аргинин), что делает невозможным его использование в качестве тест-объекта для определения метанола в сложных по составу средах. Изобретение заключается в том, что штамм метилотрофных бактерий. 75, облигатно утилизирующих метанол и метиламин, мажет быть использован как индикатор присутствия этих соединений в сточных водах предприятий. Предлагаемый штамм. 75 является облигатным по отношению к метанолу, что позволяет обнаружить это соединение в сложных по составу средах. По сравнению с прототипом заявляемый штамм использует метиловый спирт в значительно более низких концентрациях (начиная от 0,1 об.), что обеспечивает гораздо более высокую чувствительность метода. Скорость роста штамма высокая, и стационарной фазы культура достигает через 14 часов, что сокращает время определения. 1973 1 Кроме того, штамм способен утилизирозать метиламин - простейший алифатический амин, который обладает высокой канцерогенной активностью и оказывает острое токсическое действие на метаболизирующие системы. Сведений о способах химического и микробиологического определения этого соединения в патентной и научно-технической литературе не имеется. С помощью заявляемого штамма может быть выявлено присутствие метиламина в концетрациях от 0,01 до 3. Новый штамм. 75 выделен из сточных вод Минского кожевенного объединения. Культурально-морфологические свойства. Клетки - бесцветные, подвижные мелкие палочки (1-1,5 х 2 мкм) с перитрихиальным жгутикованием. Размножаются простым делением, не имеют капсул и спор, образуют большое количество полисахаридов. Культура в жидкой среде растет без агрегации клеток, с равномерным помутнением. Колонии на агаризованной среде круглые, непрозрачные, молочного цвета,диаметром 2-3 мм, поверхность гладкая, профиль выпуклый, край ровный, консистенция вязкая. Среды для выращивания жидкая минеральная среда (или минимальный агар) с метанолом (1 об.) или метиламином (2). Физиолого-биохимические признаки. Строгий аэроб, температурный оптимум 30 С, оптимум рН 6,87,2. В витаминах и дополнительных факторах роста не нуждается, пигментов не образует. Штамм устойчив к ампициллину (до 2000 мкг/мл), оксициллину (более 1000 мкг/мл), стрептомицину (100 мкг/мл) и чувствителен к налидиксовой кислоте, хлорамфениколу, канамицину, тетрациклину и рифампицину. Имеет оксидазу, каталазу и уреазу. Нитраты восстанавливает до нитритов. Индол, сероводород и аммиак не образует. Гидролизует крахмал и лецитин, но не желатину. Реакция Фогес-Проскауэра и тест нае отрицательные. Штамм является облигатным метилотрофом. Источниками углерода для роста служат метанол и метиламин, которые утилизируются по рибулозомонофосфатному пути. Штамм хранится в коллекции НИЛ молекулярной генетики бактерий Белорусского государственного университета. При длительном хранении штамм лиофилизируют. В лабораторных условиях культура поддерживается на чашках с минимальной агаризованной средой и пересевается через 1 месяц. Пример 1. Культуру. 75 выращивают в жидкой минимальной среде с метанолом(1 об. ) в течение суток. 10 мл суспензии вносят в колбы объемом 250 мл с 90 мл среды следующего состава, в г/л дистиллированной воды КН 2 РО 4-2,0 (4)24-2,0 аС 1-0,5 М 47 Н 2-0,025 Са 120,00125 рН 7,0. Среду стерилизуют при 1 атм 30 мин. Пробу, содержащую метанол, вносят перед посевом. Культуру выращивают на качалке при 140 об/мин и 30 в течение суток. Спектрофотометрические измерения проводят при длине волны 540 нм. Показания снимают дважды непосредственно после засева культуры и через сутки. В качестве контроля используют среду с инокулятом без добавления метанола. Разница между начальной и конечной оптической плотностью свидетельствует об интенсивности роста культуры. Количество метанола в пробе определяют, исходя из показаний оптической плотности (А 540) культуры с использованием калибровочного графика. На рисунке изображена калибровочная кривая оптической плотности штамма. 75, выращенного на различных концентрациях метанола. Пример 2. Посевной материал тест-культуры и последующие процедуры проводят аналогично примеру 1, однако в качестве источника углерода и энергии в используемые минеральные среды добавляют пробу, содержащую метиламин. Штамм выращивают 24 часа и спектрофотометрируют при 540 нм перед началом культивирования и после него. Количество присутствующего в пробе метиламина определяют по калибровочному графику. Преимущества заявляемого штамма. 75 состоят в том, что его использование в качестве тест-объекта для обнаружения метанола в сточных водах промышленных предприятий и значительно увеличивает чувствительность и специфичность метода, а также позволяет сократить время анализа. Кроме того, штамм пригоден для выявления метиламина. оставитель А.И. Сорокин Редактор В.Н. Позняк Корректор Т.Н. Никитина Заказ 3990 Тираж 20 экз. Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66. 2