Способ модификации поверхности полупроводниковых нанокристаллов (квантовых точек) для использования их в биологии и медицине

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ МОДИФИКАЦИИ ПОВЕРХНОСТИ ПОЛУПРОВОДНИКОВЫХ НАНОКРИСТАЛЛОВ (КВАНТОВЫХ ТОЧЕК) ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИХ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт химии новых материалов Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Еремин Александр Николаевич Агабеков Владимир Енокович Жавнерко Геннадий Константинович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт химии новых материалов Национальной академии наук Беларуси(57) 1. Способ модификации гидрофобной поверхности полупроводниковых квантовых точек , отличающийся тем, что в обращенных мицеллах, образованныхв неполярном органическом растворителе, в частности изооктане, октане или гептане, при молярном отношении 2/, равном 11,9-27,0, солюбилизируют сначала функционализирующее биосовместимое соединение, а затем квантовые точки , растворенные в неполярном органическом растворителе, в частности изооктане, октане или гептане, полученную смесь обрабатывают ультразвуком в течение 1-2 мин, при необходимости путем добавления активирующего соединения активируют функционализированные квантовые точки, затем конъюгируют с ними биомолекулы, полученные функционализированные квантовые точки или конъюгаты выделяют из обращенных мицелл АОТ и фотоактивируют их в водной среде, включающей 50 мМ 3. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве функционализирующего биосовместимого соединения используют тиоглицерин, дитиотреит, -цистеин, бычий сывороточный альбумин, иммуноглобулинбарана, стрептавидин, полиэлектролит или их смесь. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве активирующего соединения используют глутаровый альдегид. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве биомолекулы используют антитела, белки или нуклеиновые кислоты. 17861 1 2013.12.30 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что квантовые точкивыделяют из обращенных мицеллметодом центрифугирования, предварительно разрушив их, последовательно добавляя солевую смесь, в частности 3 ии ацетон. 6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что квантовые точкифотоактивируют, используя естественное освещение или люминесцентную лампу, в 50 мМ водном растворе 3, в который добавляют 20 мМ цитрата натрия и 5 мМ тиоглицерина, или 20 мМ цитрата натрия и 0,02 мг/мл полиаллиламингидрохлорида, или 20 мМ цитрата натрия и 0,15 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, или 20 мМ цитрата натрия, 0,15 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и 5 мМ тиоглицерина, или 1,0 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и 0,2 твина 85. Изобретение относится к способу формирования биосовместимого покрытия на поверхности флуоресцирующих полупроводниковых нанокристаллов (квантовых точек), которые после этого могут быть использованы как люминесцентные метки в биологии и медицине при выявлении и определении вирусов, бактерий, белков, нуклеиновых кислот и других биообъектов. Флуоресцирующие квантовые точки обладают уникальными оптическими характеристиками, выгодно отличающими их от органических люминофоров 1, 2. В настоящее время коммерчески доступны интенсивно люминесцирующие квантовые точки, включающие ядро , покрытое оболочкой , отличающиеся совершенной кристаллической структурой, малым разбросом по размерам, устойчивостью к фотодеструкции. Однако квантовые точкиявляются гидрофобными, так как покрыты триоктилфосфиноксидом (ТОФО), и растворимы только в органических растворителях (хлороформ, толуол, гептан, октан т.п.) 1, 2. Для использования флуоресцирующих квантовых точекв биологически совместимых средах на их поверхности необходимо сформировать гидрофильное покрытие, фрагменты которого позволили бы присоединить к нему биомолекулы. Известны способы включения квантовых точекв полимерные или кварцевые микро- и наносферы 1, 3. Например, для получения квантовых точек ,включенных в микро- или наносферы полистирола, последние помещают в хлороформ. Затем добавляют квантовые точкив бутаноле, которые диффундируют внутрь этих разбухших полимерных сфер. После внедрения квантовых точекв полимерную матрицу растворитель удаляют, а обратное сжатие полимера при удалении растворителя фиксирует внедренные квантовые точкивнутри сфер. Известны способы, основанные на непосредственной адсорбции бифункциональных лигандов, способных связываться с поверхностными атомами цинка или серы квантовых точекчерез фосфиновые или тиольные группы (меркаптокислоты 4-7, цистеин 8, 9 и т.п.), -группы, введенные методом химической модификации в молекулы этиленгликоля 10, ДНК 11, белков или пептидов 1, 2. В этих способах концентрированный раствор лиганда в метаноле (воде) добавляют к квантовым точкам , растворенным в хлороформе (или диметилформамиде, гептане, тетрагидрофуране). Связывание -групп лигандов с поверхностными атомами цинка или серы приводит к вытеснению молекул ТОФО с поверхности квантовых точек . В результате они выпадают в осадок из органического растворителя, или же их осаждают метанолом, этанолом, пропанолом, ацетоном, а затем диспергируют в воде, где и проводят конъюгирование биомолекул с функционализированными квантовыми точками . Известны способы, которые не предполагают удаление ТОФО с поверхности квантовых точек , но в этом случае вокруг них формируют липидный или полимерный защитный слой, гидрофобные фрагменты которого встраиваются в оболочку ТОФО, а по 2 17861 1 2013.12.30 лярные остаются экспонированными в водную среду 1, 2. В этих способах используют фосфолипиды (фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин), модифицированный полимер акролеиновой кислоты, производные 3-(диметиламино)-1-пропиламина, амфифильные триблоксополимеры и сахариды. Их гидрофильные фрагменты, экспонированные в окружающий водный раствор, полимеризуют, формируя изолирующую полярную оболочку,содержащую активные группы для присоединения к ним биомолекул. Наиболее близкими техническими решениями к заявляемому изобретению являются способы, где применяются поверхностно-активные вещества (ПАВ) 9, 12-15. Известен способ подготовки растворимых в воде квантовых точекс использованием анионного ПАВ аэрозоля ОТ (АОТ). Квантовые точки , покрытые ТОФО, растворяют в 5 АОТ в гексане, а затем растворитель удаляют путем упаривания под вакуумом. Полученный растворимый в воде продукт содержит квантовые точки ,покрытые смесью АОТ и ТОФО 12. Известен способ приготовления растворимых в воде квантовых точекпутем их обработки додецилсульфатом натрия (ДДСН) 9. Несколько миллиграмм квантовых точекрастворяют в тетрагидрофуране, в который добавляют ДДСН. Отношение молярной концентрации квантовые точки ПАВ составляет от 11 до 11000. Смесь перемешивают несколько часов, а затем растворитель испаряют при комнатной температуре. Полученный порошок диспергируют в воде с помощью ультразвука. Известен способ формирования полисилоксановой оболочки вокруг квантовых точек в обратной микроэмульсии неионогенного ПАВ (синпероник -5, игепал -520,тритон -101) в циклогексане 13-15. Сначала готовят раствор ПАВ в циклогексане. Затем в этот раствор последовательно добавляют аликвоты квантовых точекв хлороформе, циклогексана, воды, тетраэтилортосиликата и аммиака. Между добавлениями реакционную смесь размешивают в течение 15 мин. После чего смесь на одну неделю помещают в темноту при комнатной температуре. Квантовые точки , покрытые силикатной оболочкой, выделяют путем центрифугирования, используя этанол для осаждения частиц и их промывки. Осадок квантовых точекдиспергируют в водной среде для их последующей функционализации биомолекулами. Общим недостатком вышеприведенных способов является их многоступенчатость,требующая проведения операций гидрофилизации квантовых точек , их активации и иммобилизации на них биообъектов в соответствующих средах. В то же время известно, что обращенные мицеллы ПАВ в неполярном органическом растворителе позволяют не только солюбилизировать в них наночастицы, но и биомолекулы 16, которые сохраняют в этой среде свою стабильность и функциональные свойства, например каталитическую и иммунную активности 17. Обращенные мицеллы АОТ используют для выделения и очистки белков 18. Кроме того, в обращенных мицеллах АОТ можно эффективно предотвратить агрегацию как исходных наночастиц, так и их функционализированных форм. Задача изобретения состоит в том, чтобы разработать способ, позволяющийудалять с поверхности квантовых точекнесовместимое с водой стабилизирующее покрытие из молекул ТОФО, функционализировать освобожденную лиофобную поверхность квантовых точекбиосовместимыми соединениями, активировать их и конъюгировать биомолекулы с функционализированными квантовыми точкамипутем проведения всех этих операций в обращенных мицеллах АОТ. Поставленная задача решается оптимальной последовательностью объединения компонентов в обращенных мицеллах АОТ, когда вначале в растворе АОТ в неполярном органическом растворителе (например, гептан, октан, изооктан) солюбилизируют функционализирующее соединение, например, тиольное производное (тиоглицерин, дитиотреит, -цистеин и т.п.), полимер (белки, полиэлектролиты) или смесь низкомолекулярного соединения и полимера, и только после этого в полученные обращенные мицеллы 3 17861 1 2013.12.30 АОТ вносят аликвоту квантовых точек , растворенных в органическом растворителе (например, гептан, октан, изооктан), после чего обращенные мицеллы АОТ обрабатывают в ультразвуковой ванне, выдерживают при комнатной температуре и функционализированные квантовые точкивыделяют из обращенных мицелл АОТ после их разрушения, например, смесью солевого раствора с ацетоном путем центрифугирования. Для получения конъюгатов биомолекул с функционализированными квантовыми точкамипоследние не выделяют из обращенных мицелл АОТ, а добавляют к нему соответствующий активатор, например глутаровый диальдегид, а затем конъюгируют биомолекулы (например, антитела, рецепторные белки) и в заключение полученные конъюгаты выделяют из обращенных мицелл АОТ. Такой способ модификации поверхности НЧ позволяет одновременно освободить поверхность квантовых точекот гидрофобного стабилизирующего покрытия и быстро связать с ними функционализирующие соединения не выделяя функционализированные квантовые точки , далее в обращенных мицеллах АОТ активировать группы на их поверхности и конъюгировать с ними биомолекулы (белки, нуклеиновые кислоты) формировать ассоциаты труднорастворимых в полярной среде низкомолекулярных соединений с квантовыми точкамиисключить применение высокотоксичных органических растворителей (хлороформ,толуол, метанол). Фиг. 1 - зависимость максимальной интенсивности (а) и положения максимума (б) флуоресценции квантовых точекот их концентрации (0,005-0,20 мг/мл) в обращенных мицеллах 50 (1) и 200 (2) мМ АОТ в изооктане при молярном отношении 2/АОТ, равном 27. Среда, использованная для одновременного освобождения квантовых точекот ТОФО и одно- или многоступенчатой функционализации их поверхности, включала аэрозоль ОТ (АОТ бис(2-этилгексил)сульфосукцинат натрия), , изооктан, водный раствор функционализирующей добавки (низкомолекулярные тиолы (тиоглицерин(ТГ), дитиотреит (ДТТ) и -цистеин), бычий сывороточный альбумин (БСА), иммуноглобулиныбарана , стрептавидин, полиэлектролит (полиаллиламингидрохлорид(ПАА) с молекулярной массой 15 кДа), глутаровый альдегид (ГА. Обращенные мицеллы АОТ способны солюбилизировать большое количество квантовых точек(фиг. 1). В широком диапазоне концентрации квантовых точек практически нет различия в их интенсивности флуоресценции в обращенных мицеллах с разным содержанием ОТ (50 и 200 мМ 27). Для эффективного включения квантовых точекв обращенные мицеллы АОТ смесь необходимо обработать 1-2 мин в ультразвуковой ванне. Фиг. 2 - влияние молярного отношения 2/АОТ в обращенных мицеллах 200 мМ АОТ на интенсивность (а) и положение максимума (б) флуоресценции квантовых точек(3). Порядок внесения квантовых точекв среду АОТквантовые точки 2 функционализирующая добавкаизооктан. Концентрация воды в обращенных мицеллах АОТ является важным фактором, так как определяет интенсивность флуоресценции квантовых точек , количество функционализирующей добавки, которое можно включить в обращенные мицеллы АОТ, эффективность связывания компонентов функционализирующей добавки с квантовыми точками . От того, в каком порядке сформированы многокомпонентные обращенные мицеллы АОТ, зависит эффективность процесса освобождения квантовых точек от исходной гидрофобной стабилизирующей оболочки и замена ее на другую,придающую частицам способность растворяться в водной среде и связывать биомолекулы. Сравнение эффективности двух последовательностей формирования обращенных ми 4 17861 1 2013.12.30 целлл АОТ, отличающихся порядком внесения квантовых точекв среду (1 АОТквантовые точки 2 функционализирующая добавкаизооктан(фиг. 3, показало, что квантовые точкинеобходимо вводить в раствор в последнюю очередь, когда в системе уже солюбилизированы функционализирующие добавки. Добавки, включенные в обращенные мицеллы АОТ после квантовых точек, плохо защищают последние от тушителей флуоресценции (фиг. 2). В то же время БСА, ПАА, будучи солюбилизированными в обращенных мицеллах АОТ раньше квантовых точек(второй способ формирования обращенных мицелл АОТ),эффективно препятствуют тушению их флуоресценции (фиг. 3). Фиг. 3 - влияние молярного отношения 2/АОТ в обращенных мицеллах 200 мМ АОТ на интенсивность (а) и положение максимума (б) флуоресценции ассоциатов квантовых точек(0,05 мг/мл) с БСА (0,22 мг/мл БСА) (1) или ПАА-15 (0,02 мг/мл) (2). Порядок внесения квантовых точекв среду АОТ 2 функционализирующая добавкаизооктанквантовые точки . Способ приготовления обращенных мицелл АОТ определяет оптимальную концентрацию функционализирующей добавки в среде (фиг. 4 и 5). Различия в интенсивности флуоресценции квантовых точекнивелируются лишь при высоком содержании добавки. Если квантовые точкисолюбилизировать в обращенных мицеллах АОТ в последнюю очередь, то требуется меньшая концентрация функционализирующей добавки, чем при осуществлении модификации квантовых точекпервым способом. Фиг. 4 - зависимость интенсивности (а) и положения максимума (б) флуоресценции 0,05 мг/мл квантовых точекот концентрации БСА в обращенных мицеллах 200 мМ АОТ в изооктане (2/АОТ 27), приготовленных первым (1 АОТквантовые точки 2 БСАизооктан) или вторым (2 АОТ 2 БСАизооктанквантовые точки ) способом. Фиг. 5 - зависимость интенсивности (а) и положения максимума (б) флуоресценции 0,05 мг/мл квантовых точекот концентрации тиоглицерина в обращенных мицеллах 200 мМ АОТ в изооктане (2/27), приготовленных первым (1 АОТквантовые точки(2 АОТ 2 ТГизооктанквантовые точки ) способом. Таким образом, квантовые точкилегко встраиваются в обращенные мицеллы АОТ, которые концентрируют в полярном ядре функционализирующие добавки и стабилизируют ассоциат между добавкой и квантовыми точками . Эффективность процесса функционализации поверхности квантовых точекзависит от порядка формирования обращенных мицелл АОТ. Квантовые точкинеобходимо вводить в обращенные мицеллы АОТ в последнюю очередь, когда в системе уже солюбилизированы функционализирующие добавки. Фиг. 6 - кинетика изменения флуоресценции конъюгатов )-ПАА) (1),БСА)-ПАА) (2), БСА)-БСА) (3-5), ТГ)-БСА) (6) в разных водных растворах при комнатной температуре и естественном освещении 1 и 2 50 мМ 3 с 100 мМ 3-50 мМ 3 с 1,0 мг/мл БСА, 4-50 мМ 3 с 0,1 тритона -100 5-50 мМ 3 с 0,1 твина 85 6-100 мМ 3 с 1,0 мг/мл БСА. Обращенные мицеллы АОТ, включающие функционализированные квантовые точки, весьма стабильны. Чтобы выделить квантовые точкииз этой среды,обращенные мицеллы АОТ необходимо разрушить. Для разрушения обращенных мицелл АОТ и выделения из них квантовых точекиспользуют ацетон в смеси с водным раствором солей (50 мМ 3 с 200 мМ ). Функционализированные квантовые точки , переведенные из обращенных мицелл АОТ в водную среду, при 5 17861 1 2013.12.30 естественном или искусственном освещении во времени увеличивают интенсивность флуоресценции, а их растворы характеризуются меньшей величиной светорассеяния. В процессе фотоактивации практически полностью восстанавливается флуоресценция квантовых точек , функционализированных БСА в обращенных мицеллах АОТ(фиг. 6). Функционализация поверхности квантовых точекявляется первым этапом в процессе получения частиц, пригодных для использования в биологии и медицине. Далее необходимо активировать квантовые точки , для того чтобы ковалентно связать с ними биоактивное соединение (например, антитела, рецепторные белки). Для активации функционализированных квантовых точекможно использовать глутаровый альдегид (ГА), так как это доступный и недорогой реактив. Сравнена эффективность разных способов активации 2-групп в обращенных мицеллах АОТ (фиг. 7). Эти способы отличались порядком внесения ГА в обращенные мицеллы АОТ 1. БСАквантовые точкиБСАГАактивированный ПАА (фиг. 7, кривая 5). 4. ПААквантовые точкиПАА, БСАГАактивированный БСАПактивированный ПААБСА (фиг. 7, кривая 6). ГА не влияет на флуоресценцию квантовых точек(фиг. 7, точки 1, 2), так как не взаимодействует с ними. Оптимальная концентрация ГА определяется количеством доступных аминогрупп полимера. Наименьшее их число у ассоциата квантовых точек с БСА, а наибольшее - у квантовых точекс ПАА. В последнем случае оптимальная концентрация альдегида составляет 0,1 мМ при содержании в обращенных мицеллах АОТ 0,05 мг/мл квантовых точеки 0,02 мг/мл ПАА-15. Предпочтительно обрабатывать ГА-ассоциаты квантовых точекс БСА (фиг. 7,кривая 3) или ПАА (кривая 5) или же связывать предварительно активированный БСА с ассоциатом квантовых точекс ПАА (кривая 6), что является наиболее эффективным. В этом случае готовят два раствора обращенных мицелл 200 мМ АОТ в изооктане. Один из них включает 0,04 мг/мл ПАА-15 и 0,10 мг/мл квантовых точек(1,5), а второй - 2,5-20,0 мкМ ГА и 0,14 мг/мл БСА (6,8). Растворы обрабатывают ультразвуком, инкубируют 1 ч при комнатной температуре, а затем их объединяют и повторно воздействуют ультразвуком. Полученный образец выдерживают 1 ч при комнатной температуре. Фиг. 7 - влияние глутарового диальдегида на интенсивность флуоресценции квантовых точек(1, 2), ассоциатов квантовых точекс БСА (3, 4), ПАА (5),ПАА и активированным БСА (6) в обращенных мицеллах 200 мМ АОТ в изооктане, содержащих 1,8 (6) или 5,0 мМ 3 (1-5). Обращенные мицеллы АОТ позволяют иммобилизовать иммуноглобулинына квантовые точкикак путем физической адсорбции, так и ковалентно. Антитела ковалентно конъюгировали с квантовыми точками , функционализированными ПАА-15 (фиг. 8) и БСА (фиг. 9). Прежде чем добавлятьв обращенные мицеллы АОТ,2-группы ассоциатов квантовых точекс полимерами активировали ГА в течение 30 мин 20 и 80 мкМ ГА для- БСА и- ПАА соответственно. Разные концентрациипрактически не влияют на интенсивность флуоресценции конъюгата )-ПАА) как через 3 (фиг. 8, кривая 1), так и 24 (кривая 2) ч конъюгирования. Инкубирование реакционного раствора в течение суток способствует усилению флуоресценции квантовых точек . В процессе конъюгированияс активированным ассоциатом -БСА (фиг. 9) также наблюдается усиление флуо 6 17861 1 2013.12.30 ресценции конъюгата в обращенных мицеллах АОТ, но не столь значительное, как в случае )-ПАА). При выделении конъюгата )-ПАА) из обращенных мицелл АОТ уменьшается его флуоресценция (кривая 3), но в процессе фотоактивации она не только восстанавливается, но и усиливается (фиг. 6). Тиоглицерин, добавленный в реакционную среду на последней стадии синтеза конъюгата, не влияет на связи между квантовыми точкамии белком или поликатионом. Для инактивации свободных альдегидных групп в последней стадии синтеза конъюгатов можно использовать тиоглицерин, дитиотреит и БСА. Фиг. 8 - зависимость флуоресценции конъюгатов )-ПАА) от концентрации иммуноглобулиновв обращенных мицеллах 150 мМ АОТ в изооктане (18,8)1 через 3 и 2 - через 24 ч конъюгированияс ассоциатами -ПАА, активированными 80 мкМ ГА, 3 - конъюгат )-ПАА) в водном растворе 50 мМ 3 с 100 мМ . Эффективность фотоактивации конъюгатов после их выделения из обращенных мицелл АОТ зависит от состава водной среды (фиг. 6). БСА (кривая 3) и твин 85 (кривая 5) являются лучшими добавками в 50 мМ 3, так как способствуют усилению флуоресценции конъюгата. Увеличение интенсивности флуоресценции конъюгатов в водной среде после их выделения из обращенных мицелл АОТ происходит только на свету. Кинетическая кривая 6 (фиг. 6) отражает изменение флуоресценции конъюгата ТГ)-БСА) в растворе 100 мМ 3 с 1,0 мг/мл БСА. Начальный участок кривой характеризует флуоресценцию конъюгат в процессе хранения его в темноте при 6 С. После того как конъюгат поместили на свет при комнатной температуре, его интенсивность флуоресценции увеличилась в 1,8 раза. Аналогичные данные получены и для ассоциата. Чтобы сохранить высокий уровень флуоресценции, необходимо хранить ассоциаты и конъюгаты на свету, так как при размещении в темноте снижается их интенсивность флуоресценции. Фиг. 9 - зависимость флуоресценции конъюгата )-БСА) от концентрациив обращенных мицеллах 150 мМ АОТ в изооктане (22,8)1 - через 3 и 2 - через 24 ч конъюгированияс ассоциатами -БСА, активированными 20 мкМ ГА. Пример 1. Функционализация квантовых точектиоглицерином. Готовят 400 мМ раствор АОТ в изооктане, 1,25 мг/мл квантовых точекв изооктане, 280 мМ раствор тиоглицерина в дистиллированной воде. К 525 мкл АОТ добавляют 50,6 мкл воды,25 мкл ТГ, 743 мкл изооктана и 56 мкл квантовых точек . Объем образца составляет 1,4 мл. Конечные концентрации компонентов 150 мМ АОТ, 5 мМ ТГ, 0,05 мг/мл квантовых точек . Отношение 2/АОТ 20. После добавления каждого компонента смесь перемешивают, добиваясь однородности и прозрачности обращенных мицелл АОТ. После внесения квантовых точеки перемешивания обращенные мицеллы АОТ обрабатывают в ультразвуковой ванне (Сапфир 5.7, Россия) в течение 11 мин. Для выделения ассоциата тиоглицерина с квантовыми точкамик 1,32 мл обращенных мицелл АОТ добавляют 200 мкл солевой смеси (50 мМ 3 с 200 мМ). Эмульсию тщательно перемешивают. Затем к смеси приливают 3 мл охлажденного ацетона, перемешивают и оставляют на 20-30 мин в морозильной камере. Расслоившийся раствор центрифугируют 15 мин при 6000 об/мин (центрифуга ОПн-8 Киргизия). Супернатант удаляют, а осадок дважды промывают (22 мл) ацетоном, центрифугируя 10 мин при 6000 об/мин. Затем осадок растворяют в водном растворе, содержащем 50 мМ 3, 20 мМ цитрат натрия и 5 мМ тиоглицерин. Фотоактивацию образца проводят при комнатной температуре, воздействуя светом люминесцентной лампы ЛД 40-2 (Россия). 17861 1 2013.12.30 Пример 2. Функционализация квантовых точекполикатионом ПАА-15. Готовят 400 мМ раствор АОТ в изооктане, 1,25 мг/мл квантовых точекв изооктане, 3 мг/мл ПАА-15 в дистиллированной воде. К 525 мкл АОТ добавляют 66,3 мкл воды, 9,3 мкл ПАА, 743 мкл изооктана и 56 мкл квантовых точек . Объем образца составляет 1,4 мл. Конечные концентрации компонентов 150 мМ АОТ, 0,02 мг/мл ПАА-15, 0,05 мг/мл квантовых точек . Отношение 2/АОТ 20. Выделяют функционализированные квантовые точкииз обращенных мицелл АОТ и фотоактивируют их так, как описано в примере 1. Промытые функционализированные квантовые точки растворяют в водном растворе, содержащем 50 мМ 3, 20 мМ цитрат натрия и 0,02 мг/мл ПАА-15. Пример 3. Функционализация квантовых точекБСА. Готовят 400 мМ раствор АОТ в изооктане, 1,25 мг/мл квантовых точекв изооктане, 8,5 мг/мл БСА в дистиллированной воде. К 525 мкл АОТ добавляют 50,9 мкл воды, 24,7 мкл БСА, 743 мкл изооктана и 56 мкл квантовых точек . Объем образца составляет 1,4 мл. Конечные концентрации компонентов 150 мМ АОТ, 0,15 мг/мл БСА, 0,05 мг/мл квантовых точек. Отношение 2/АОТ 20. Выделяют функционализированные квантовые точкииз обращенных мицелл АОТ и фотоактивируют их так, как описано в примере 1. Промытые функционализированные квантовые точкирастворяют в водном растворе, содержащем 50 мМ 3, 20 мМ цитрат натрия и 0,15 мг/мл БСА. Пример 4. Функционализация квантовых точекиммуноглобулинамибарана. Готовят 400 мМ раствор АОТ в изооктане, 1,25 мг/мл квантовых точекв изооктане,1,31 мг/мл , 280 мМ тиоглицерин в дистиллированной воде. К 525 мкл АОТ добавляют 23,9 мкл воды, 26,7 мкл , 743 мкл изооктана и 56 мкл квантовых точек . После добавления каждого компонента смесь перемешивают, добиваясь однородности и прозрачности обращенных мицелл АОТ. После внесения квантовых точеки перемешивания, обращенные мицеллы АОТ обрабатывают в ультразвуковой ванне в течение 11 мин. Образец выдерживают 10 мин, а затем в обращенные мицеллы АОТ вносят 25 мкл ТГ и воздействуют ультразвуком 1 мин. Объем образца составляет 1,4 мл. Конечные концентрации компонентов 150 мМ АОТ, 0,025 мг/мл , 0,05 мг/мл квантовых точек , 5,0 мМ ТГ. Отношение 2/АОТ 20. Выделяют функционализированные квантовые точкииз обращенных мицелл АОТ и фотоактивируют их так, как описано в примере 1. Промытые функционализированные квантовые точки растворяют в водном растворе, содержащем 50 мМ 3, 20 мМ цитрат натрия, 0,15 мг/мл БСА и 5 мМ тиоглицерин. Пример 5. Функционализация квантовых точекстрептавидином. Готовят 400 мМ раствор АОТ в изооктане, 1,25 мг/мл квантовых точекв изооктане, 2,7 мг/мл стрептавидина в дистиллированной воде, 280 мМ тиоглицерин в дистиллированной воде. К 525 мкл АОТ добавляют 39,5 мкл воды, 11,1 мкл стрептавидина, 743 мкл изооктана и 56 мкл квантовых точек . После добавления каждого компонента смесь перемешивают, добиваясь однородности и прозрачности обращенных мицелл АОТ. После внесения квантовых точеки перемешивания обращенные мицеллы АОТ обрабатывают в ультразвуковой ванне в течение 11 мин. Образец выдерживают 10 мин, а затем в обращенные мицеллы АОТ включают 25 мкл ТГ и воздействуют ультразвуком 1 мин. Объем образца составляет 1,4 мл. Конечные концентрации компонентов 150 мМ АОТ, 0,02 мг/мл стрептавидин, 0,05 мг/мл квантовых точек , 5,0 мМ ТГ. Отношение 2/20. Выделяют функционализированные квантовые точкииз обращенных мицелл АОТ и фотоактивируют их так, как описано в примере 1. Промы 8 17861 1 2013.12.30 тые функционализированные квантовые точкирастворяют в водном растворе,содержащем 50 мМ 3, 20 мМ цитрат натрия, 0,15 мг/мл БСА и 5 мМ тиоглицерин. Пример 6. Активирование ассоциата БСА глутаровым альдегидом. Готовят 400 мМ раствор АОТ в изооктане, 1,25 мг/мл квантовых точекв изооктане, 20 мг/мл БСА в 5 мМ водном растворе 3, 200 мМ 3, 20 мМ водный раствор ГА. К 750 мкл АОТ добавляют 37,5 мкл 3, 7,5 мкл БСА, 642 мкл изооктана и 60 мкл квантовых точек . После добавления каждого компонента смесь встряхивают, добиваясь однородности и прозрачности обращенных мицелл АОТ. Полученные обращенные мицеллы АОТ обрабатывают ультразвуком два раза по 1 мин в ультразвуковой ванне и выдерживают 15 мин. Затем в обращенные мицеллы АОТ вносят 3 мкл 20 мМ ГА, помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин, и выдерживают 1 час при комнатной температуре. Конечные концентрации компонентов 200 мМ АОТ, 5 мМ 3, 0,1 мг/мл БСА,0,05 мг/мл квантовые точки , 40 мкМ ГА. Отношение 2/АОТ 11,9. Выделение активированного ассоциата БСА проводят так, как это описано в примере 1. Пример 7. Активирование ассоциата ПАА глутаровым альдегидом. Готовят 400 мМ раствор АОТ в изооктане, 1,25 мг/мл квантовых точекв изооктане, 3 мг/мл ПАА-15 в дистиллированной воде, 200 мМ 3, 20 мМ водный раствор ГА. К 750 мкл АОТ добавляют 37,5 мкл 3, 5 мкл ПАА, 642 мкл изооктана и 60 мкл квантовых точек . После добавления каждого компонента смесь встряхивают, добиваясь однородности и прозрачности обращенных мицелл АОТ. Полученные обращенные мицеллы АОТ обрабатывают ультразвуком два раза по 1 мин в ультразвуковой ванне. Затем в обращенные мицеллы АОТ вносят 6 мкл 20 мМ ГА, помещают в ультразвуковую ванну на 2 мин и выдерживают 30 мин при комнатной температуре. Общий объем обращенных мицелл АОТ - 1,5 мл. Конечные концентрации компонентов 200 мМ АОТ, 5 мМ 3,0,01 мг/мл ПАА-15, 0,05 мг/мл квантовых точек , 80 мкМ ГА. Отношение 2/АОТ 12,8. Выделение активированного ассоциата ПАА проводят так, как это описано в примере 1. Пример 8. Конъюгирование иммуноглобулиновбарана с активированным глутаровым альдегидом ассоциатом БСА. Готовят 400 мМ раствор АОТ в изооктане, 1,25 мг/мл квантовых точекв изооктане, 20 мг/мл БСА в 5 мМ аНСОз, 1,3 мг/мл ,200 мМ 3, 300 мМ водный раствор тиоглицерина, 20 мМ водный раствор ГА. К 525 мкл АОТ добавляют 21 мкл 3, 6 мкл БСА, 749 мкл изооктана и 56 мкл квантовых точек . После добавления каждого компонента смесь встряхивают, добиваясь однородности и прозрачности раствора. Полученные обращенные мицеллы АОТ обрабатывают ультразвуком два раза по 1 мин в ультразвуковой ванне. Затем в обращенные мицеллы АОТ вносят 2,8 мкл 20 мМ ГА, помещают в ультразвуковую ванну на 2 мин, и выдерживают 30 мин при комнатной температуре. После в обращенные мицеллы АОТ добавляют 26,7 мкл , обрабатывают ультразвуком два раза по 1 мин в ультразвуковой ванне и выдерживают 5 ч при комнатной температуре. Затем в обращенные мицеллы АОТ вносят 14 мкл ТГ, обрабатывают ультразвуком два раза по 1 мин в ультразвуковой ванне и оставляют на ночь при температуре 4-6 С. Общий объем обращенных мицелл АОТ 1,4 мл. Конечные концентрации компонентов 150 мМ АОТ, 3 мМ 3, 0,085 мг/мл БСА, 0,05 мг/мл квантовых точек , 40 мкМ ГА, 0,025 мг/мл , 3 мМ ТГ. Отношение 2/АОТ 18,6. Выделяют конъюгат ТГ)-БСА) из обращенных мицелл АОТ и фотоактивируют его так, как описано в примере 1. Промытый конъюгат растворяют в водном растворе, содержащем 50 мМ 3, 1,0 мг/мл БСА и 0,2 твин 85. 17861 1 2013.12.30 Пример 9. Конъюгирование иммуноглобулиновбарана с активированным глутаровым альдегидом ассоциатом ПАА. Готовят 400 мМ раствор АОТ в изооктане, 1,25 мг/мл квантовых точекв изооктане, 3 мг/мл ПАА-15 в дистиллированной воде,1,3 мг/мл , 200 мМ 3, 200 мМ тиоглицерин, 20 мМ водный раствор ГА. К 525 мкл АОТ добавляют 21 мкл 3, 6,1 мкл ПАА, 755 мкл изооктана и 56 мкл квантовых точек . После добавления каждого компонента смесь встряхивают, добиваясь однородности и прозрачности обращенных мицелл АОТ. Полученные обращенные мицеллы АОТ обрабатывают ультразвуком два раза по 1 мин в ультразвуковой ванне. Затем в обращенные мицеллы АОТ вносят 5,6 мкл ГА, помещают в ультразвуковую ванну на 2 мин и выдерживают 30 мин при комнатной температуре. После в обращенные мицеллы АОТ добавляют 12,8 мкл , обрабатывают ультразвуком (41 мин) в ультразвуковой ванне и выдерживают 5 ч при комнатной температуре. Затем в обращенные мицеллы АОТ вносят 21,2 мкл ТГ, обрабатывают ультразвуком два раза по 1 мин в ультразвуковой ванне и оставляют на ночь при температуре 4-6 С. Общий объем обращенных мицелл АОТ 1,4 мл. Конечные концентрации компонентов 150 мМ АОТ, 3 мМ 3, 0,013 мг/мл ПАА-15, 0,05 мг/мл квантовых точек , 80 мкМ ГА, 0,012 мг/мл , 3 мМ ТГ. Отношение 2/АОТ 17,6. Выделяют конъюгат ТГ)-ПАА) из обращенных мицелл АОТ и фотоактивируют его так, как описано в примере 1. Промытый конъюгат растворяют в водном растворе, содержащем 50 мМ 3, 1,0 мг/мл БСА и 0,2 твин 85. Источники информации 1.,,,.,//. - 2005. - . 4. - о. - . 435-446. 2. Олейников В.А., Суханова А.В., Набиев И.Р. Флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы в биологии и медицине // Российские нанотехнологии. - 2007. - Т. 2. -12. - С. 160-173. 3..,.,... - 2008. - . 20. - о. 7. - . 2503-2512. 16. Хмельницкий Ю.Л., Левашов А.В., Клячко Н.Л., Мартинек К. Микрогетерогенная среда для химических (ферментативных) реакций на основе коллоидного раствора воды в органическом растворителе // Успехи химии. - 1984. - Т. 53. -4. - С. 545-565. 17. Еремин А.Н., Метелица Д.И. Гомогенный иммуноферментный анализ прогестерона в обращенных мицеллах ПАВ // Докл. АН БССР. - 1989. - Т. 33. -10. - С. 932-935. 18. Еремин А.Н., Метелица Д.И. Выделение ферментов из смешанных обращенных мицелл ПАВ // Прикл. биохим. и микробиол. - 1988. - Т. 24. -1. - С. 42- 49. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 14