Способ определения предрасположенности к раку яичников

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАКУ ЯИЧНИКОВ(71) Заявители Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(72) Авторы Чакова Наталья Николаевна Михаленко Елена Петровна Крупнова Эвелина Вячеславовна Чеботарева Наталья Вячеславовна Демидчик Юрий Евгеньевич Шелкович Светлана Евгеньевна Майсеня Елена Николаевна(73) Патентообладатели Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(56) ЧАКОВА Н.Н. и др. Доклады Национальной академии наук Беларуси. 2009. - Т. 53. -4. - С. 92-96.2296328 1, 2007.2303634 1, 2007.. . 2001. - . 22. - . 1. - . 67-72.. . 2001. - . 22. - . 1. - . 63-65.... 2008. - . 28. - . 3079-3081..,. - 2000. - . 9. . 29-42.(57) Способ определения предрасположенности к раку яичников, включающий выделение ДНК пациента, отличающийся тем, что проводят генотипирование гена 1 с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции и гена 2 с использованием полимеразной цепной реакции и судят о предрасположенности к раку яичников при выявлении комбинации генотипов 1(-) и 2 481/590/857. Изобретение относится к области молекулярно-генетических исследований в медицине и может быть использовано в онкологии. В структуре онкологической патологии женского населения злокачественные опухоли яичников составляют 4-6 и являются главной причиной смертности онкогинекологических больных во многих странах мира. В большинстве случаев рак яичников (РЯ) обнаруживается на поздних стадиях развития и характеризуется агрессивным клиническим течением. Одним из молекулярных методов, расширяющим возможности диагностики РЯ,является анализ генетического полиморфизма ферментов, ответственных за метаболизм ксенобиотиков в организме. 17882 1 2013.12.30 В литературе широко обсуждается вопрос о влиянии полиморфизма генов, кодирующих ферменты биотрансформации ксенобиотиков (ФБК), на формирование риска целого ряда новообразований, т.к. одной из основных причин развития онкопатологии являются неблагоприятные факторы окружающей среды. К наиболее изученным ферментам, играющим ключевую роль в процессах детоксикации ксенобиотиков, относятся -ацетилтрансферазыи глутатион-8-трансферазы . Известно также, что некоторые ФБК, в частности глутатион-8-трансферазы, участвуют в биосинтезе и метаболизме стероидных гормонов, поэтому влияние генетического полиморфизма ФБК на функционирование органов репродуктивной сферы может быть связано с модификацией кинетики биосинтеза и распада андрогенов и эстрогенов. Прототипом предлагаемого изобретения по техническому исполнению является анализ генетического полиморфизма ферментов второй фазы биотрансформации ксенобиотиков 2, 1 и 1 1. Описанный способ предполагает деление обследованных индивидуумов на группы быстрых и медленных ацетиляторов, в состав которых входит несколько гаплотипов, и не позволяет оценить вклад отдельного гаплотипа в формирование предрасположенности к РЯ. Задача изобретения состоит в повышении эффективности выявления у женщин предрасположенности к РЯ, в упрощении процесса анализа и уменьшении материальных затрат. Предлагаемый способ заключается в определении гаплотипа 2 и генотипа 1 у обследуемой женщины и является более информативным благодаря учету индивидуальных генетических особенностей ацетилирования. Указанный технический результат достигается тем, что выделяют ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции, проводят генотипирование фермента 2 по трем сайтам (481, 590 и 857) и фермента 1 и прогнозируют риск возникновения рака яичников. Использованные праймеры и эндонуклеазы рестрикции представлены в таблице. Последовательность праймеров и используемые эндонуклеазы рестрикции Последовательность праймеров Размер Нуклеотидная ЭндоГен 53 продукта замена нуклеаза-1 215 п.н. делеция-Способ состоит из шести этапов и осуществляется следующим образом. Этап 1. Выделение ДНК по стандартному протоколу. Этап 2. Типирование образцов по генам 1 с применением мультиплексной ПЦР. В качестве внутреннего контроля используется амплификация фрагмента гена альбумина. Смесь для амплификации объемом 15 мкл включала 100-200 нг ДНК (2 мкл) 0,4 мкМ прямого и обратного праймеров 1 0,09 мкМ прямого и обратного праймеров альбумина 7,5 мкл -2(ОДО Праймтех, Минск). Начальное плавление проводят в течение 5 мин при температуре 95 С, далее проводят 30 циклов,включающих плавление при температуре 95 С в течение 30 с, отжиг при температуре 64 С в течение 1 мин, синтез при температуре 72 С в течение 1 мин. Финальный синтез проводят при температуре 72 С в течение 5 мин. Этап 3. Проведение стандартной ПЦР для амплификации 2. Смесь объемом 40 мкл включает 100-200 нг ДНК (2 мкл) 0,15 мкМ прямого и обратного праймеров 20,0 мкл -2(ОДО Праймтех, Минск). Начальное плавление 2 17882 1 2013.12.30 проводят в течение 7 мин при температуре 94 С, далее проводят 30 циклов, включающих плавление при температуре 94 С в течение 40 с, отжиг при температуре 59 С в течение 40 с, синтез при температуре 72 С в течение 1 мин. Финальный синтез проводят при температуре 72 С в течение 5 мин. Этап 4. Гидролиз амплифицированного фрагмента 2 эндонуклеазами (таблица)(генетический полиморфизм 481)(генетический полиморфизм 590)(генетический полиморфизм 857). Этап 5. Фракционирование продуктов амплификации 1 и продуктов рестрикции эндонуклеазойв 1,2 -ном и фракционирование продуктов рестрикции эндонуклеазами ,- в 2,5 -ном агарозпом геле с бромистым этидием при напряжении 1 В/см и визуализация в УФ-свете. Этап 6. Анализ полученных результатов. В случае выявления гаплотипа 2 (481 и 590 и 857) и гомозиготной делеции 1(-) судят о наличии предрасположенности к раку яичников. Проведено клинико-генетическое изучение группы больных РЯ (196 человек), проходивших лечение в Минском городском онкологическом диспансере в период с 2008 по 2010 гг. В контрольную выборку вошли 142 женщины без онкопагологии, постоянно проживающие на территории Беларуси. Были выявлены статистически значимые различия по частоте встречаемости комбинации гаплотипа 2 (481 и 590 и 857) и гомозиготной делеции (-) у больных и в контрольной группе (24,430,042). Данный способ позволяет определять предрасположенность к возникновению РЯ у женщин, что дает возможность формировать скрининговые программы по созданию групп риска по возникновению РЯ. Женщина, являющаяся носителем комбинации гаплотипа 2 (481 и 590 и 857) и гомозиготной делеции 1(-), имеет повышенный риск возникновения РЯ и нуждается в углубленном клиническом обследовании и диспансерном наблюдении для своевременной диагностики этого заболевания. Источники информации 1. Чакова Н.Н. и др. Доклады Национальной академии наук Беларуси. - 2009. - Т. 53.4. - С. 92-94. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3