Штамм бактерий Bifidobacterium lactis ВКПМ Ас-1673, используемый для приготовления кисломолочного ферментированного или неферментированного пищевого продукта, биологически активной добавки, бактериального препарата или косметического средства

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ШТАММ БАКТЕРИЙВКПМ АС-1673,ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КИСЛОМОЛОЧНОГО ФЕРМЕНТИРОВАННОГО ИЛИ НЕФЕРМЕНТИРОВАННОГО ПИЩЕВОГО ПРОДУКТА, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ, БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА ИЛИ КОСМЕТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА(71) Заявитель Открытое акционерное общество Вимм-Билль-Данн(72) Авторы Вустина Татьяна Федоровна Перминов Сергей Игоревич Мозговая Ирина Николаевна(73) Патентообладатель Открытое акционерное общество Вимм-Билль-Данн(57) Штамм бактерийВКПМ Ас-1673, используемый для приготовления кисломолочного, ферментированного или неферментированного пищевого продукта,биологически активной добавки, бактериального препарата или косметического средства. Изобретение относится к новым штаммам бифидобактерий и их использованию в пищевой, косметической, биотехнологической, медицинской промышленности и ветеринарии с целью укрепления здоровья. Заявляемый штамм, в частности, может использоваться при приготовлении кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов. В связи с неблагоприятными экологическими условиями, длительной и, иногда, бессистемной антибиотикотерапией увеличивается количество людей и животных, страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. Для лечения и профилактики этих нарушений все большее внимание уделяется как препаратам, обладающим пробиотическим действием, так и пищевым продуктам, содержащим бифидобактерии. Продукты, содержащие бифидобактерии, являются эффективным средством профилактики, а также лечения различных желудочно-кишечных заболеваний, а также кишечных дисбактериозов, обусловленных перенесенными кишечными и другими заболеваниями,длительной антибиотикотерапией, лучевой и химиотерапией, стрессовыми воздействиями, неблагоприятными условиями окружающей среды и другими факторами. 13359 1 2010.06.30 Устойчивость бактерий к условиям желудочно-кишечного тракта является важным критерием для отбора штаммов, способствующих укреплению здоровья. Качество лечебно-профилактических продуктов и препаратов во многом обусловлено свойствами штамма-продуцента - его специфической активностью и технологичностью. Большой ассортимент биологически активных и технологичных штаммов бифидобактерий делает возможной разработку новых моно- и комплексных продуктов лечебнопрофилактического питания и бакпрепаратов, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека и животных, восстановить их нормальную микрофлору и снизить заболеваемость различными кишечными инфекциями. Известны зарубежные моно- и комплексные препараты - эубиотики и кисломолочные продукты, включающие в свой состав бифидобактерии видовпатент 2336886, МПК 23 9/12, 1977,,,патент 2411008, МПК 61 35/74, 1979,,патент СН 637297, МПК 61 39/02, 1983,патент 6379663, МПК 01 63/00, 2002. В нашей стране для приготовления бактерийных препаратов и продуктов лечебнодиетического питания применяют штаммы бифидобактерий видовВКПМ Ас-1578 патент 2152993, МПК 12 01/20, 2000,ВКПМ -1257 патент 2108383, МПК 12 01/20, 1998,379,791 патент 2092064, МПК 23 09/12, 1997,-42 а.с. СССР 863639, МПК 12 15/00, 1981. В кисломолочных продуктах, обогащенных бифидобактериями, используют и зарубежные штаммы,например,-019 патент 2208632, МПК 12 01/20, 2003,420 спецификация на штамм,420 компании 2003. До настоящего времени ничего не известно об использовании отечественных штаммовв вышеуказанных областях. Наиболее близким к заявляемому штамму является штамм 420(прототип) спецификация на штамм,420 компании ,2003. Штамм обладает антагонистической активностью в отношении некоторых патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. По ряду проверенных свойств известный штамм 420 уступает заявляемому штамму 668, в частности, он более чувствителен к фенолу, желчи и менее активен в отношении некоторых патогенных микроорганизмов(табл. 1 и табл. 2). Задачей настоящего изобретения является получение штамма микроорганизмов видадля использования его при изготовлении кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, биологически активных добавок, бактерийных препаратов, косметических средств и т.п. средств, содержащих бифидобактерии. При решении поставленной задачи достигаются следующие технические результаты штамм обладает высокой биологической активностью, в частности высокой антиоксидантной активностью (супероксиддисмутазной активностью) в сравнении с информацией,имеющейся в литературных источниках, устойчивостью к условиям внешней среды, быстро размножается на искусственных питательных средах, обладает кислотообразующей и антагонистической активностью в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Получение штаммов, обладающих подобными свойствами, способствует расширению ассортимента пробиотиков, используемых для поддержания здоровья, в частности для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожных и слизистых покровов человека и животных. 13359 1 2010.06.30 Поставленная задача реализуется путем использования штамма 668 (-1673 ВКПМ) в составе заквасок, продуктов питания, лекарственных, бактериальных, косметических средств и т.д. Штамм 668 может быть использован в моно- или композиционной пробиотической концепции при получении или изготовлении различных заквасок,кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, бактериальных препаратов, косметических средств. Штамм 668 выделен из содержимого кишечника здорового ребенка и депонирован в ВКПМ (Россия, Москва, 113545, 1-й Дорожный проезд, 1, ГНИИГ-ВКПМ) подАс-1673. Заявляемый штамм выживает в условиях, имитирующих условия желудочнокишечного тракта (ЖКТ), в частности, в присутствии 40 желчи, 0,4 фенола, ферментов ЖКТ и при низких значениях рН. Заявляемый штамм 668 может быть использован при производстве кисломолочной продукции, ферментированных пищевых продуктов таких как квас и т.п., неферментированных пищевых продуктов, например соки, напитки и т.п., заквасок и биологически активных добавок к пище. Также штамм 668 может широко использоваться для производства косметических средств, например кремов, лосьонов, питательных масок, гелей, косметического молочка и т.д. Кроме того, штамм 668 может быть использован и при производстве бактериальных препаратов в виде свечей, пероральных и других средств. Культуральные, морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма 668. Клетки представляют собой грамположительные, неподвижные, неспорообразующие,каталазоотрицательные, анаэробные, полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2-х концах в жидких питательных средах растут по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза при росте на агаризованной среде ГМК в анаэробных условиях образуют мелкие (до 1 мм в диаметре) круглые бесцветные колонии. Оптимальная температура выращивания 37-39 С. Штамм 668 сбраживает глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, салицин, ксилозу, арабинозу, раффинозу с образованием уксусной и молочной кислот, без образования газа сквашивает молоко к 32 ч с образованием сгустка активно наращивает микробную массу при росте на кукурузно-лактозной среде(ГМК-1) (состав ГМК-1 кукурузно-молочная смесь - 15 г пептон - 15 г лактоза - 9 г аскорбиновая кислота - 0,5 г натрий лимоннокислый трехзамещенный - 0,6 г магний сернокислый - 0,12 г калий фосфорнокислый однозамещенный - 2 г натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1 г агар - 3 г дистиллированная вода - 1 л), бифидум среде (БФ)(состав бифидум среды глюкоза - 7,5 г лактоза - 2,5 г панкреатический гидролизат казеина - 30 г натрий хлористый - 2,5 г магний сернокислый - 0,5 г -цистеин - 0,5 г аскорбиновая кислота - 0,5 г дрожжевой экстракт - 5 г ацетат натрия - 0,3 агар - 0,75 г дистиллированная вода - 1 л) максимально накапливает микробную массу к 12-24 ч, достигая в 1 млКОЕ (колониеобразующие единицы), равного 8-9 проявляет антагонистические свойства в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры (табл. 1 и 2 приведены в конце описания), а именно более чем в 100 раз угнетают рости, более чем в 10000 раз угнетают рост,, более чем в 100000 раз угнетают рост,,при совместном культивировании в условиях. Таким образом, предлагаемый штамм 668 технологичен, поскольку активно размножается в питательной среде с накоплением производственной биомассы в 3 13359 1 2010.06.30 короткие, 12-24 ч, сроки культивирования с высокой концентрацией микробных клеток ( КОЕ 9) обладает кислотообразующими и ингибирующими свойствами в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры, высокой антиоксидантной активностью (супероксиддисмутазной активностью, СОД-активность равна 95,00,1 в ед/мг белка). Кроме того, изучение спектра чувствительности к антибиотикам и антибактериальным препаратам выявило, что штамм 668 обладает природной устойчивостью к азтреонаму, амикацину, гентамицину, канамицину, неомицину, нетилмицину, полимиксину, сизомицину, стрептомицину, сульфаниламиду, тобрамицину, цефтазидиму чувствителен к левомицетину, ампициллину, бензилпенициллину, ванкомицину, доксициклину,карбенициллину, линкомицину, меропенему, оксациллину, олеандомицину, офлоксацину,пиперациллину, рифампицину, фурагину, фурадонину, фуразолидону, цефепиму, цефотаксиму, цефтриаксону, цефуроксиму. Таким образом, по ряду свойств и их совокупности штамм 668 обладает большей биологической активностью по сравнению с известными штаммами. Штамм 668 обладает устойчивостью к фенолу и желчи устойчивостью к низким значениям рН и ферментам ЖКТ выраженной антагонистической активностью в отношении,,,,,природной устойчивостью к азтреонаму, амикацину, гентамицину, канамицину, неомицину, нетилмицину, полимиксину, сизомицину,стрептомицину, сульфаниламиду, тобрамицину, цефтазидиму хорошей технологичностью (способностью штамма вырастать в большом титре, равном-9, на подобранных средах и хорошо сохраняться в кисломолочных продуктах в течение необходимого продолжительного срока годности) выраженной антиоксидантной активностью. Способность штамма 668 вырастать в большом титре в питательной среде в короткие сроки культивирования, его антагонистическая, кислотообразующая, антиоксидантная активности, способность сохраняться в течение длительного времени в кисломолочной продукции и другие полезные свойства делают возможным использование штамма в составе различных продуктов питания и средств лечебнопрофилактического назначения. Пример 1. Использование штамма 668 в составе биологических веществ, в частности в составе биологически активных добавок. 1 пассаж лиофилизированный штамм 668 в количестве - 0,1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной бифидум средой и титруют методом десятикратных разведений до 10-9. Инкубируют при температуре 37-38 С до образования видимого роста в последних разведениях. 2 пассаж выросшую культуру из 10 разведений в объеме до 10 вносят в питательную бифидум среду и культивируют при температуре 37-38 С в течение 12-24 ч до образования густого роста с видимой зоной аэробиоза. 3 пассаж полученную биомассу в количестве до 10 объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38 С до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 108 КОЕ/мл. В результате получают биологически активную добавку, которая представляет собой суспензию клеток бифидобактерий 668 с титром не менее 108 КОЕ/мл,при необходимости можно получить концентрат клеток бифидобактерий с более высоким титром. Пример 2. Использование штамма 668 для приготовления неферментированных пищевых продуктов. 1 пассаж лиофилизированный штамм 668 в количестве 0,1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной бифидум средой и титруют методом де 4 13359 1 2010.06.30 сятикратных разведений до 109. Инкубируют при 37-38 С до образования видимого роста в последних разведениях. 2 пассаж выросшую культуру из 1079 разведений в объеме до 10 вносят в питательную бифидум среду и культивируют при температуре 37-38 С в течение 12-24 ч до образования густого роста с хорошо видимой зоной аэробиоза. 3 пассаж полученную биомассу в количестве до 10 объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38 С до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 108 КОЕ/мл. Получение неферментированного пищевого продукта выросшую и, при необходимости, сконцентрированную биомассу вносят в пищевое сырье (молоко, соки и пр.), перемешивают и разливают в емкости. В результате получают продукт с концентрацией живых бифидобактерий не менее 106 КОЕ/мл. Пример 3. Приготовление кисломолочного продукта лечебно-профилактического назначения с использованием штамма 668 в качестве компонента заквасочных культур для приготовления ферментированных кисломолочных продуктов. 1 пассаж лиофилизированный штамм вносят в бифидум среду культивирования и титруют методом десятикратных разведений до 109. Инкубируют при 37-38 С до образования видимого роста в последних разведениях. 2 пассаж выросшую культуру штамма 668 из последних разведений вносят в среду накопления объемом до 10 и культивируют при температуре 3738 С до получения биомассы с содержанием бифидобактерий не менее 108 КОЕ/мл. 3 пассаж полученную биомассу в количестве до 10 объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38 С до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 108 КОЕ/мл. Получение кисломолочного продукта полученную биомассу штамма 668 в объеме до 10 вносят в пастеризованную молочную смесь при температуре 37-38 С вместе с другими заквасочными культурами, используемыми по норме, культивируют до образования сгустка (рН 4,5-4,6). Продукт, с концентрацией живых бифидобактерий 668 не менее 106 КОЕ/мл, охлаждают до 22 С, разливают в тару и доохлаждают до 6 С. Количество пассажей может быть увеличено в зависимости от объема производства. Пример 4. Использование штамма бифидобактерий 668 для получения бактериальных препаратов. Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную бифидум среду, культивируют при температуре 37-38 С до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 108 КОЕ/мл. К полученной биомассе добавляют защитные среды высушивания (сахарозо-желатиновая среда, обезжиренное молоко). Полученную суспензию разливают в ампулы или флаконы, или другие емкости, замораживают при температуре минус 40-45 С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуумсушильных аппаратах. Полученный препарат содержит не менее 108 живых клеток бифидобактерий 668 в 1 г. Формируя дозы адекватного уровня потребления пробиотических микроорганизмов в сутки равные не менее 5108-51010 КОЕ (для бифидобактерий) можно использовать полученный препарат в качестве бактериального препарата пробиотика. Пример 5. Использование штамма бифидобактерий 668 для получения косметических средств. Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную бифидум среду, культивируют при температуре 37-38 С до получения биомассы бифидобактерий 5 668 с содержанием живых клеток не менее 108 КОЕ/мл. Получение косметических средств выросшую биомассу (при необходимости концентрат) штамма 668 бифидобактерий вводят в состав косметического средства. Пример 6. Использование штамма бифидобактерий 668 для получения ферментированного продукта. Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду (бифидум), культивируют при температуре 37-38 С до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 108 КОЕ/мл. Для получения ферментированного продукта типа кваса выросшую биомассу (при необходимости концентрат) штамма бифидобактерий 668 вводят в подготовленную основу (вода, сахар, мед, сусло, аскорбиновая кислота) совместно си, перемешивают и культивируют при 37 С до получения напитка с титруемой кислотностью 65-85 Т. Затем напиток охлаждают и разливают по бутылкам. В результате получают готовый лечебно-профилактический продукт с содержанием в 1 мл не менее 107 живых пробиотических микроорганизмов. Антагонистическая активность штаммов 668 (заявляемый) и 420 (прототип) в отношении патогенных микроорганизмов. Таблица 1 Численность патогенных микроорганизмов,(/мл) Падение численности патогенных микроорганизмов при совместном культивировании с бифидобактериями,(/мл) Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6