Консорциум штаммов бактерий Bifidobacterium adolescentis для получения пробиотического продукта или препарата

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ БАКТЕРИЙДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРОДУКТА ИЛИ ПРЕПАРАТА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Новик Галина Ивановна Самарцев Андрей Анатольевич Рябая Наталья Евгеньевна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Консорциум штаммов бактерийБИМ В-87 Д иБИМ В-375 Д для получения пробиотического продукта или препарата. Изобретение относится к биотехнологии, пищевой и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве пробиотических продуктов и препаратов с лечебно-профилактическими и лечебными свойствами. Широкий ассортимент производимых в настоящее время пищевых продуктов и лечебно-профилактических препаратов, содержащих в своем составе бифидобактерии и продукты их метаболизма, объясняется полученными многочисленными доказательствами позитивного влияния этих микроорганизмов и продуктов их метаболизма на организм человека. Они подавляют жизнедеятельность патогенных микроорганизмов, синтезируют витамины, участвуют в выведении токсических продуктов и др. Применение таких продуктов и препаратов позволяет эффективно нормализовать микрофлору кишечника, улучшить обмен веществ, усилить иммунитет. Бифидобактерии доминируют в кишечном микробиоценозе здорового человека и играют важную роль в поддержании в норме гомеостаза организма. Из литературы известно, что бифидобактерии образуют экзополисахариды и другие гликоконъюгаты, связанные с поверхностью клеточной стенки бактерий. Установлено иммунокорригирующее, противоопухолевое, радиопротекторное действие этих биополимеров 1, 2. В связи с этим промышленный интерес представляет разработка условий, при которых возможны их сверхсинтез и в то же время сохранение других биологически значимых и практически ценных свойств бифидобактерий, как, например, широкий спектр 11710 1 2009.04.30 ферментативной активности, выраженный антагонизм в отношении патогенной микрофлоры, высокий колонизационный потенциал и другие 3. Известен консорциум бифидобактерий для приготовления кисломолочных, неферментированных пищевых продуктов и бактерийных препаратов 4. Недостатком данного консорциума является использование в его составе представителей пяти различных видов бифидобактерий, выделенных от разных людей, поскольку в этом случае высока вероятность подавления одних видов другими при их совместном развитии. После приготовления, согласно патенту, продуктов и препаратов специалистам будет весьма затруднительно идентифицировать находящиеся в них штаммы. Помимо общеизвестного позитивного воздействия бифидобактерий и продуктов их жизнедеятельности на организм человека, штаммы не обладают какими-либо дополнительными практически значимыми свойствами. Недостатками также являются низкая сквашивающая активность штаммов(только к 24 ч культивирования) и трудоемкость способа, связанная с культивированием и поддержанием в жизнеспособном состоянии пяти различных видов бифидобактерий. Задачей изобретения является получение штаммов бифидобактерий, входящих в состав консорциума, обладающих такими практически значимыми свойствами, как повышенный уровень продукции протеолитических ферментов и органических кислот,образование комплекса экзополисахаридов со свойствами иммуномодулятора, устойчивость к неблагоприятным факторам желудочно-кишечного тракта (желчь, низкий и высокий , резистентность к хлористому натрию и др.), высокие скорость роста и уровень накопления биомассы на различных питательных средах. Штаммы должны иметь близкие физиолого-биохимические характеристики, чтобы их использование в составе консорциума не приводило к возможному подавлению жизнеспособности и утрате практически значимых свойств. В Институте микробиологии НАН Беларуси с использованием селекционного метода получены штаммы бифидобактерийБИМ В-87 Д и В.БИМ В-375 Д. 1. Факторы и условия адаптации и селекции. Для культивирования бифидобактерий использовали среду следующего состава (г/л) лактоза - 10, дрожжевой экстракт - 4, гидролизат казеина - 10, 24122 - 2,24 - 2, 47 Н 2 О - 0,2, 332 - 5, аммоний цитрат 3-водный - 3, цистеин гидрохлорид - 0,1, агар - 1, 2 дист. - остальное,среды доводили до 7,0. Температура культивирования составляла 371 С. Продолжительность культивирования - 18-20 ч. Для проведения селекции и получения штамма В.БИМ В-87 Д с повышенным уровнем протеолитической активности проводили последовательный пересев культуры на питательной среде вышеприведенного состава, в которой проводили постепенное снижение содержания гидролизата казеина (на 1 г/л каждые две недели до содержания 2 г/л) и постепенное увеличение содержания белка казеината натрия (на 1 г/л каждые две недели до содержания 8 г/л) с регулярной проверкой уровня протеолитической активности и жизнеспособности на каждом этапе. Адаптацию проводили в течение 6 месяцев. Периодичность пересевов составляла 2-4 раза в неделю в зависимости от показателей активности и жизнеспособности. Температура культивирования составляла 371 С. Продолжительность культивирования - 18-20 ч. В результате проведения селекции уровень протеолитической активности штамма в сравнении с исходным вариантом был увеличен примерно в 3 раза. Приобретенный признак сохранялся при поддержании штамма на типовой питательной среде при длительном (более 12 месяцев) хранении. Селекцию и получение штамма В.БИМ В-375 Д с повышенным уровнем протеолитической активности и способного расти в питательной среде, содержащей желчь до 1 , проводили в два этапа. На первом этапе проводили последовательную адаптацию исходного штамма бифидобактерий к присутствию желчи в среде культивирования вышеприведенного состава. Адаптацию проводили в течение 8 месяцев. Начинали адапта 2 11710 1 2009.04.30 цию с содержания желчи в среде 0,1 и постепенно повышали его на 0,1 раз в однудве недели в зависимости от показателей физиологической активности и жизнеспособности культуры. Периодичность пересевов составляла 2-3 раза в неделю в зависимости от показателей активности и жизнеспособности. Температура культивирования составляла 371 С. Продолжительность культивирования - 24-48 ч. На втором этапе осуществляли повышение уровня продукции протеолитических ферментов у варианта бифидобактерий,способного расти в присутствии 1 желчи в среде культивирования. Селекцию по данному признаку проводили так же, как описано для штамма В.БИМ В-87 Д. Однако в данном случае среда культивирования содержала желчь в количестве 1 . В результате проведения селекции был получен вариант бифидобактерий, способный расти в присутствии 1 желчи в среде и обладающий повышенным в 2 раза уровнем продукции протеолитических ферментов. Приобретенный признак сохранялся при поддержании штамма на типовой питательной среде при длительном (более 12 месяцев) хранении. 2. Соотношение и заменяемость индивидуальных компонентов. Соотношение штаммов в консорциуме 11. Замена одного из штаммов консорциума каким-либо другим штаммом бифидобактерий, не заявленным в консорциуме, невозможна, поскольку один из штаммов консорциума образует экзополисахарид, а другой обладает уникальной для бифидобактерий особенностью - способностью расти в присутствии в среде 1 желчи. 3. Делимость. Для предпочтительной изоляцииБИМ В-87 Д из консорциума используют питательную среду следующего состава (г/л) лактоза - 10, дрожжевой экстракт - 4, гидролизат казеина - 8, казеинат- 2, 24122 - 2, 24 - 2,472 - 0,2, 332 - 5,- 1, аммоний цитрат 3-водный - 3, цистеин гидрохлорид - 0,1, агар - 1, 2 дист. - остальное,6,8-7,0. Температура культивирования 371 С. Продолжительность культивирования - 18-20 ч. Для предпочтительной изоляцииБИМ В-375 Д из консорциума используют питательную среду следующего состава (г/л) лактоза - 10, дрожжевой экстракт - 4, гидролизат казеина - 8, казеинат- 2, желчь - 7, 24122 - 2,24 - 2, 472 - 0,2, 332 - 5,- 1, аммоний цитрат 3-водный - 3,цистеин гидрохлорид - 0,1, агар - 1, 2 дист. - остальное,среды 6,8-7,0. Температура культивирования - 371 С. Продолжительность культивирования - 18-20 ч. 4. Стабильность и/или конкурентоспособность. Консорциум штаммов стабилен и сохраняет свои свойства при длительном хранении и периодических пересевах (раз в 10-14 дней) на типовой питательной среде для бифидобактерий. Конкурентоспособность - способность расти в присутствии 1 желчи. 5. Физиологические особенности консорциума в целом. Консорциум характеризуется высокой активностью роста на типовых питательных средах для бифидобактерий - до 31010. При выращивании на жидких питательных средах образует поверхностную стерильную зону в 0,5-1,0 см, при посеве последовательных разведений - отдельные колонии в виде чечевичек или комет. Консорциум штаммов каталазу не образует, нитраты не восстанавливает, желатин не разжижает, способен ферментировать арабинозу, глюкозу, ксилозу, мальтозу, лактозу, рафинозу, целлобиозу без образования газа. Глюкозу ферментирует до уксусной, -молочной кислот и этанола. Консорциум штаммов сохраняет жизнеспособность в условияхв присутствии в среде 1 желчи и 2,5 хлористого натрия, устойчив к терапевтическим дозам антибиотиков тетрациклинового ряда и макролидам. Оптимум температурного роста 371 С. Пределы 4,0-8,0. Оптимум- 7,0. Штаммы консорциума непатогенные, нетоксигенные. 11710 1 2009.04.30 Штаммы депонированы в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов(научная коллекция типовых и промышленно ценных непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАНБ). Культурально-морфологические признаки штаммов близкие. Клетки грамположительные, неподвижные, спор не образуют. Палисадный тип расположения клеток в мазке, короткие прямые или искривленные разветвленные палочки с булавовидными утолщениями на концах. Факультативные анаэробы, при глубинном посеве на жидкие питательные среды образуют поверхностную стерильную зону в 0,5-1,0 см. При посеве последовательных разведений - колонии В.БИМ В-375 Д образуют отдельные колонии в виде мелких чечевичек или комет колонии В.БИМ В-87 Д более крупные, в виде чечевичных зерен, реже комет или гвоздиков. При анаэробном выращивании в атмосфере инертных газов на плотных питательных средах образуют круглые, гладкие, однородно кремовые или белые непрозрачные пастообразные 1-3 мм колонии с ровными краями. Физиолого-биохимические признаки штаммов. Штамм В.БИМ В-87 Д характеризуется высокой активностью роста на различных питательных средах для культивирования бифидобактерий, средах на основе молочной сыворотки и на обезжиренном молоке ( КОЕ до 10,3). Отличительным признаком штамма является продукция экзополисахаридного комплекса, обладающего иммуногенными свойствами, при одновременном повышенном уровне продукции протеолитических ферментов, способных гидролизовать белковые субстраты (таблица). Штамм В.БИМ В-375 Д характеризуется высокой активностью роста на различных питательных средах для культивирования бифидобактерий ( КОЕ до 10,2). Отличительный признак штамма - повышенный уровень продукции протеолитических ферментов и способность к активному росту в присутствии в среде культивирования 1 желчи (таблица). Штаммы каталазу не образуют, желатин не разжижают. Ферментируют арабинозу,глюкозу, ксилозу, мальтозу, лактозу, раффинозу, целлобиозу. Глюкозу сбраживают с образованием уксусной, -молочной кислот и этанола. Оптимальная температура роста 37-38 С. Оптимальный начальныйроста 7,0-7,2. Штаммы консорциума сохраняют жизнеспособность в условияхв присутствии в среде культивирования 2,5 хлористого натрия, 1 желчи, а также приот 4,0 до 8,0. Устойчивы к терапевтическим дозам гентамицина, канамицина, нетромицина, фортума, амфотерицина, стрептомицина. Антагонистически активны в отношении различных биоваров,,. Пример 1 Получение пробиотического продукта. Проводят репарацию лиофилизированных культур В.БИМ В-87 Д и В.БИМ В-375 Д. Для этого их вносят в питательную среду, выдерживают в течение получаса при комнатной температуре, после чего переносят в термостат, где выращивают при температуре 37-38 С в течение суток и получают культуругенерации. Выросшую биомассу в количестве 5-6 вносят питательную среду и получают культурыгенерации, которые переносят в емкости большего объема и получают культурыгенерации. Титр бактерий при этом достигает 1,5-2,51010 клеток в 1 мл. Полученную на питательной среде биомассу смешивают, получая консорциум. Внесение консорциума в жидкие пищевые продукты (молоко и др.) в пропорции 1100 позволяет получить пробиотический продукт без проведения ферментации с высоким титром (1,5-2,5108) жизнеспособных клеток бифидобактерий. Пример 2 Получение пробиотического препарата. 11710 1 2009.04.30 Активные культуры клеток бифидобактерий В.БИМ В-87 Д и В.БИМ В-375 Дгенерации используют для получения пробиотического препарата. Для этого к выросшей биомассе бактерий в жидкой питательной среде добавляют стабилизатор (стерильный насыщенный раствор натрия двууглекислого) для нейтрализации органических кислот до 7,0 и перемешивают до получения однородной суспензии. Отбирают пробы для проверки биологической активности. Полученный бактериальный пробиотический препарат содержит в 1 мл не менее 1109 - 11010 жизнеспособных клеток. Биологическая активность штаммов консорциума в сравнении со штаммом-прототипом Протеолитическая ак- Рост в присутствии 1 жел- Сквашивание обезШтамм тивность, усл. ед.,чи в среде культивирования жиренного молока при 3,0(время,КОЕ) Прототип 122 6,2 16-18 ч 9,5 В.450 6,9 10-12 ч 9,8 БИМ В-87 Д В.316 10,1 12-14 ч 9,6 БИМ В-375 Д- инокулят в количестве 5 ,КОЕ после образования сгустка. Таким образом, предлагаемый консорциум отличается от известного тем, что штаммы бифидобактерий обладают высокой скоростью роста и уровнем накопления биомассы на различных питательных средах, высокой устойчивостью к неблагоприятным факторам желудочно-кишечного содержимого, продуцируют протеолитические ферменты и экзополисахариды. Штаммы в составе консорциума характеризуются высокой биологической активностью, технологичны и могут использоваться для получения пробиотических продуктов и препаратов. Источники информации 1. , ., , Т., , ., , ., , Т.,, .//. - 1985. - .45. - . 1300-1307. 2. , ., , ., , ., , ., , ., , ., . // . . . - 1997. - .61. - . 312-316. 3.// . . . .- 2001.- .73. 399-405. 4.2109054 1, МПК 23 9/12,12 1/20, опубл. 01.04.97 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5