Способ криоконсервирования бактериофагов молочнокислых бактерий

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Рахуба Денис Викторович Новик Галина Ивановна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(56).. - 1966. - . 14. - . 3. - . 421-424. РАХУБА Д.В. и др. Молодежь в науке. - 2007. - Весц Нацыянальнай акадэм навук Беларус Приложение.(57) Способ криоконсервирования бактериофагов молочнокислых бактерий, отличающийся тем, что готовят фаголизат, содержащий бактериофаги с титром 109-1010 БОЕ/мл,добавляют в него сахарозу до концентрации 10 , замораживают до 20 С, снижая температуру со скоростью 4 С/мин, и помещают на хранение в жидкий азот. Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии и пищевой промышленности, в частности к методам долгосрочного хранения промышленно-ценных культур микроорганизмов, и может найти применение в области производства продуктов питания. В настоящее время бактериофаги молочнокислых бактерий активно применяются на производствах кисломолочных продуктов для селекции штаммов бактерий, устойчивых к вирусной инфекции. Необходимость селекции молочнокислых бактерий связана с тем, что бактериальные закваски, применяемые на предприятиях молочной промышленности, являются благоприятной средой для развития популяций бактериофагов, что часто приводит к лизису бактериальных культур и снижению активности заквасок и выражается в серьезном экономическом ущербе. Для проведения эффективной селекционной работы на предприятиях создаются производственные коллекции бактериофагов. При создании подобных депозитариев неизменно ставится вопрос о длительном хранении вирусов бактерий с поддержанием их жизнеспособности и сохранением физиологических свойств. 16698 1 2012.12.30 Известен метод длительного хранения бактериофагов молочнокислых бактерий, заключающийся в насыщении стерильных кругов фильтровальной бумаги фаголизатом с последующим высушиванием 1. Однако данный метод не обеспечивает удовлетворительного уровня выживаемости бактериофагов, а также их генетической стабильности. Для бактериофага Т 4 описан метод лиофилизации, обеспечивающий длительное сохранение жизнеспособности вируса 2. Основным недостатком данного метода является высокий риск возникновения генетических нарушений на этапе высушивания под вакуумом 3, 4. Наиболее близким по достигаемому результату является способ низкотемпературного замораживания лизата бактериофагов с последующим хранением в морозильной камере 5. Фаголизат раскапывают по стерильным ампулам емкостью 1 мл, после чего замораживают при температуре 70 С. Данный температурный режим обеспечивает высокую скорость охлаждения. Замороженные образцы хранятся в морозильной камере при температуре 18 С. Однако данный способ имеет существенные недостатки температурный режим замораживания и хранения бактериофагов обеспечивает выживаемость фагов не более 25 отсутствуют данные о сохранении литической активности бактериофагов в отношении хозяев. Задача данного изобретения заключается в разработке нового метода хранения бактериофагов молочнокислых бактерий, обеспечивающего длительное сохранение их жизнеспособности, генетической стабильности и вирулентной активности в отношении клетокхозяев. Поставленная задача решается за счет использования медленного замораживания концентрированной суспензии бактериофагов (4 С/мин) с высоким титром вирусных частиц(109-1010 БОЕ/мл), а также с использованием 10 сахарозы в качестве криопротектора. Данный метод является современной альтернативой классическим методам криобиологии,использующим высокие скорости замораживания в жидком азоте для консервирования микроорганизмов. Одновременное применение концентрированной суспензии бактериофагов для замораживания и 10 сахарозы в качестве криопротектора является новым решением и впервые применено для длительного консервирования бактериофагов молочнокислых бактерий. Из фаголизата готовят концентрированную суспензию вирусов максимально достижимым титром жизнеспособных вирусов. Обычно титр фагов в подобных случаях достигает 109-1010 БОЕ/мл. Далее разливают ее в стерильные криопробирки и добавляют стерильный раствор сахарозы так, чтобы конечная ее концентрация в суспензии была 10 . Образцы охлаждают на ледяной бане до 0 С, после чего помещают в морозильную камеру при 20 С. Данная температура обеспечивает медленное замораживание со скоростью 4 С/мин. Дальнейшее хранение также осуществляют при температуре 20 С. Отогрев образцов проводят на водяной бане при 37 С. Культура бактериофагов готова к использованию сразу же после отогрева. Заявленное изобретение иллюстрируется следующими фигурами фиг. 1 - влияние различных режимов криоконсервации на сохранение лизирующей способности бактериофаговфиг. 2 - влияние 10 сахарозы на сохранение лизирующей способности бактериофаговфиг. 3 - морфология вирионов бактериофагов молочнокислых бактерий до и после криоконсервации а) бактериофаг, не подвергавшийся замораживанию б) бактериофаг после 4 месяцев хранения в замороженном состоянии. Суть предлагаемого изобретения иллюстрируется приведенными ниже примерами. Пример 1. Влияние скоростей охлаждения и отогрева на выживаемость бактериофагов. 2 16698 1 2012.12.30 Образцы суспензии бактериофагов в стерильных криопробирках охлаждаются в холодильнике до 0 С, после чего помещаются в морозильную камеру (20 С) и жидкий азот(196 С). Данные условия замораживания обеспечивают соответственно скорости охлаждения 4 и 100-400 С/мин. Через 24 часа образцы оттаивают на водяной бане при 37 С и в морозильной камере при 4 С, что соответствует быстрому и медленному отогреву. Титр фага определяют стандартным методом агаровых слоев 6. В качестве контроля служит суспензия бактериофагов, не подвергавшаяся криоконсервации. Таблица 1 Выживаемость бактериофагов после замораживания и отогрева с различными скоростями охлаждения Режим замора- Режим отогреСуспензия фага (БОЕ/мл) живания ва Контроль(5,310,17)10 Из приведенных данных видно, что сочетание медленного замораживания со скоростью 4 С/мин и быстрого отогрева при 37 С является оптимальным режимом криоконсервации фагов молочнокислых бактерий и обеспечивает наилучшую их сохранность(табл. 1). Пример 2. Влияние скоростей охлаждения и отогрева на сохранение лизирующей способности бактриофагов. Образцы суспензии бактериофагов в стерильных криопробирках охлаждаются в холодильнике до 0 С, после чего помещаются в морозильную камеру (20 С) и жидкий азот(196 С). Данные условия замораживания обеспечивают соответственно скорости охлаждения 4 и 100-400 С/мин. Через 24 часа образцы оттаивают на водяной бане при 37 С и в морозильной камере при 4 С, что соответствует быстрому и медленному отогреву. Сразу же после оттаивания суспензию фагов переносят в подрощенную культуру молочнокислых бактерий и инкубируют при 30 С. Каждые 30 мин отбирают равные аликвоты культуральной жидкости и измеряют оптическую плотность, по изменению которой судят о скорости лизиса фагами клеток бактерий. При замораживании суспензии фагов с медленной скоростью охлаждения (4 С/мин) скорость лизиса не отличается от контрольных значений вне зависимости от режима отогрева. В остальных случаях скорость лизиса снижается (фиг. 1). Пример 3. Влияние 10 сахарозы на выживаемость бактериофагов с . Наиболее часто используемыми криопротекторами при криоконсервации микроорганизмов, а также других биологических объектов являются ДМСО и глицерол в концентрациях 5-107. Однако данные протекторы, помимо протекторного действия при замораживании, оказывают выраженное токсическое действие, что делает невозможным их применение при криоконсервации микроорганизмов, используемых в пищевой промышленности. Исходя из этого, в качестве защитного вещества была выбрана сахароза,которая в концентрации 10 оказывает выраженный защитный эффект при замораживании многих групп микроорганизмов. В концентрированную суспензию фага, разлитую по стерильным криопробиркам, добавляют стерильный раствор сахарозы до конечной концентрации 10 . Образцы замораживают и отогревают в соответствии с режимами, описанными в примере 1. Титр 16698 1 2012.12.30 жизнеспособных фагов определяют стандартным методом агаровых слоев. В качестве контроля служит суспензия бактериофагов, не подвергавшаяся криоконсервации. Таблица 2 Влияние 10 сахарозы на выживаемость бактериофагов после замораживания и отогрева с различными скоростями охлаждения Режим замоРежим Концентрированная суспензия фага (БОЕ/мл) раживания отогрева Контроль(1,210,15)10 Из представленных данных видно, что добавление 10 сахарозы к суспензии бактериофагов приводит к значительному повышению выживаемости при всех режимах криоконсервации. При замораживании и отогреве с оптимальными скоростями выживаемость фагов составила 94,66(табл. 2). Пример 4. Влияние 10 сахарозы на сохранение лизирующей способности бактриофагов. В концентрированную суспензию фага, разлитую по стерильным криопробиркам, добавляют стерильный раствор сахарозы до конечной концентрации 10 . Образцы замораживают и отогревают в соответствии с режимами, описанными в примере 1. Исследование сохранения лизирующей способности фагов проводят, как описано в примере 2. Результаты изучения сохранения лизирующей способности бактериофагов молочнокислых бактерий при криоконсервации с добавлением 10 сахарозы при разных режимах замораживания/отогрева свидетельствуют о том, что при добавлении раствора сахарозы в суспензию фагов лизирующая способность сохраняется при криоконсервации на уровне контроля вне зависимости от режима заморозки (фиг. 2). Пример 5. Влияние концентрации вирусных частиц в среде криоконсервирования на выживаемость фагов. Для замораживания используют свежий лизат фага, а также сконцентрированную суспензию с концентрацией вирусных частиц 106 и 1010 БОЕ/мл соответственно. Криоконсервирование фагов проводят с оптимальным режимом замораживания/отогрева - медленное охлаждение в морозильной камере (4 С/мин) и быстрый отогрев на водяной бане(37 С). Помимо чистых лизата и суспензии бактериофагов, используют лизат и суспензию с добавлением стерильной сахарозы до конечной концентрации 10 . Титр выживших бактериофагов исследуют стандартным методом агаровых слоев. Таблица 3 Выживаемость бактериофагов молочнокислых бактерий в зависимости от концентрации вирусных частиц в среде консервирования Вариант опыта Лизат фага Концентрированая суспензия 6 Контроль(2,620,19)1010 Титр фага Выживаемость Титр фага Выживаемость 16698 1 2012.12.30 Из полученных данных видно, что при замораживании суспензии с высоким титром вирусных частиц достигается более высокий уровень выживаемости в сравнении с лизатом. Также стоит отметить, что данная тенденция сохраняется при внесении криопротектора в среду консервирования (табл. 3). Пример 6. Длительное хранение бактериофагов в замороженном состоянии при разных температурах. Замороженные образцы хранят в жидком азоте при температуре 196 С, а также в морозильной камере при температуре 20 С. Часть замороженных образцов оттаивают сразу же после заморозки и измеряют титр бактериофагов. Полученные показатели используются в дальнейшем в качестве контроля. Через 4 месяца хранения образцы оттаивают и исследуют титр жизнеспособных бактериофагов. При использовании заявленного способа низкотемпературного консервирования в жидком азоте обеспечивается выживаемость бактериофагов, близкая к 100(табл. 4). Таблица 4 Выживаемость бактериофагов молочнокислых бактерий при длительном хранении Концентрированная суспензия фага 10 сахароза (БОЕ/мл) Режим хранения Титр фага (БОЕ/мл) Выживаемостьконтроль после(1,490,13)1010 Пример 7. Исследование морфологии вирионов бактериофагов после криоконсервации. Суспензию бактериофагов консервируют с использованием оптимальных параметров криоконсервирования и хранят в течение 4 месяцев. После оттаивания суспензию наносят на опорные сетки, покрытые коллодиевой пленки-подложки, и контрастируют уранилацетатом. Исследование морфологии проводят на трансмиссионном электронном микроскопе-100- при увеличении 1100000. В качестве контроля служила суспензия бактериофагов, не подвергавшаяся криоконсервированию. В результате исследований не было выявлено каких-либо повреждений вирусных частиц бактериофагов, а также изменения морфологии. На микрофотографиях вирионов фага до и после криоконсервации вирусная частица состоит из продолговатой головки длиной около 150 нм и шириной около 90 нм, а также отростка длиной около 250 нм(фиг. 3). Согласно полученным данным предлагаемый способ длительного консервирования бактериофагов молочнокислых бактерий превосходит ранее предложенный метод (прототип). Преимущества предлагаемого метода заключаются в следующем 1. Оптимизация температурных режимов криоконсервирования, использование криопротекторов, а также концентрированной суспензии бактериофагов позволяют добиться более высокого уровня выживаемости бактериофагов в сравнении с ранее предложенным способом. Так, при консервировании вирусов с помощью описанного метода наблюдается потеря жизнеспособности фагов около 5 непосредственно после замораживания, а также 5 в течение 4 месяцев хранения. Суммарная потеря жизнеспособности не превышает 10 . 2. Предложенный метод, помимо высокой выживаемости бактериофагов, также обеспечивает сохранение их вирулентности. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6