Состав для криоконсервирования и способ криоконсервирования спермы быка-производителя

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СОСТАВ ДЛЯ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ И СПОСОБ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ СПЕРМЫ БЫКА-ПРОИЗВОДИТЕЛЯ(71) Заявитель Республиканское унитарное предприятие Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по животноводству(72) Авторы Шейко Иван Павлович Будевич Александр Иванович Медведев Григорий Федорович Гуминская Елена Юрьевна(73) Патентообладатель Республиканское унитарное предприятие Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по животноводству(57) 1. Состав для криоконсервирования спермы быка-производителя, отличающийся тем,что содержит раствор антибиотиков, фракцию А и фракцию Б, взятые из расчета на 1 мл спермы в следующих количествах раствор антибиотиков - 0,02 мл фракция А - до получения концентрации 200 миллионов сперматозоидов в 1 мл и фракция Б - в объеме, равном объему фракции А, причем раствор антибиотиков содержит тилозина 0,5 г, гентамицина 2,5 г, линко-спектина от 1,5 до 3,0 г, бидистиллированной воды от 95,5 до 94,0 г фракция А содержит цитрата натрия 3-замещенного пищевого 2-водного 2,9 г, лактозы химически чистой 3,58 г, желтка куриного яйца 25 г, бидистиллированной воды - 97,1 г фракция Б содержит цитрата натрия 3-замещенного пищевого 2-водного 2,4 г, лактозы химически чистой 3,58 г, желтка куриного яйца 25 г, глицерина 17,5 г, бидистиллированной воды - 82,5 г. 2. Способ криоконсервирования спермы быка-производителя, отличающийся тем,что используют состав по п. 1, причем сначала к 1 мл спермы добавляют 0,02 мл раствора антибиотиков, выдерживают 5 мин при 30 С, затем добавляют нагретую до 30 С фракцию А до получения концентрации 200 миллионов сперматозоидов в 1 мл, охлаждают в течение 2 ч до 5 С и добавляют охлажденную до 5 С фракцию Б, в объеме, равном объему фракции А, причем вносят фракцию Б тремя равными частями через 10-15 мин, разбавленную сперму выдерживают 4 ч при 5 С, после чего замораживают. Изобретение относится к животноводству, в частности к искусственному осеменению сельскохозяйственных животных. Известны среды ЛГЖ и ЛГЦЖ для криоконсервирования спермы быков-производителей,включающие лактозу, натрий лимоннокислый трехзамещенный пятиводный, глицерин,желток куриного яйца, спермосан-3 (или полимексин-М), воду бидистиллированную. Осмотическое давление данных сред составляет 285-300 миллиосмолей, кислотность 6,8-6,9 12171 1 2009.08.30 инструкция по взятию, оценке и замораживанию спермы быков-производителей на племпредприятиях. Известна среда Сан-Лакт для замораживания спермы барана, содержащая лактозу,желток куриного яйца, глицерин и дистиллированную воду, причем среда дополнительно содержит лактобрил патент РФ 2115386. Известна синтетическая среда для разбавления и замораживания спермы баранов, которая дополнительно содержит костный клей патент РФ 2198622. Недостатком данных сред является снижение подвижности спермиев, увеличение деструкции их акросомного аппарата после оттаивания и патологических форм и, как следствие,снижение оплодотворяющей способности спермиев и показателя стельности животных при искусственном осеменении. Известен способ криоконсервации спермы животных, включающий разбавление спермы средой, содержащей лактозу, сахарозу, желток куриных яиц, глицерин, спермрсан-3 и дистиллированную воду. При этом разбавленную сперму охлаждают в холодильнике до 4 С в течение 3-5 часов, а затем замораживают на охлажденной в парах азота и обработанной метилаэросилом фторопластовой пластине. Для обработки фторопластовой пластины применяют различное количество метилаэросила 1 г, 3 г и 5 г а.с. СССР 1218518. Однако в данном способе применяются дорогостоящие препараты, что нежелательно. Задача изобретения - повышение качества спермы быков-производителей после ее замораживания-оттаивания и показателя оплодотворяемости животных после искусственного осеменения с наименьшими затратами. Сущность изобретения. 1. Состав для криоконсервирования спермы быка-производителя, который содержит раствор антибиотиков, фракцию А и фракцию Б, взятые из расчета на 1 мл спермы в следующих количествах раствор антибиотиков - 0,02 мл фракция А - до получения концентрации 200 миллионов сперматозоидов в 1 мл и фракция Б - в объеме, равном объему фракции А, причем раствор антибиотиков содержит тилозина 0,5 г, гентамицина 2,5 г,линко-спектина от 1,5 до 3,0 г, бидистиллированной воды от 95,5 до 94,0 г фракция А содержит цитрата натрия 3-замещенного пищевого 2-водного 2,9 г, лактозы химически чистой 3,58 г, желтка куриного яйца 25 г, бидистиллированной воды -97,1 г фракция Б содержит цитрата натрия 3-замещенного пищевого 2-водного 2,4 г, лактозы химически чистой 3,58 г, желтка куриного яйца 25 г, глицерина 17,5 г, бидистиллированной воды - 82,5 г. 2. Способ криоконсервирования спермы быка-производителя, в котором используют состав по п. 1, причем сначала к 1 мл спермы добавляют 0,02 мл антибиотиков, выдерживают 5 мин при 30 С, затем добавляют нагретую до 30 С фракцию А до получения концентрации 200 миллионов сперматозоидов в 1 мл, охлаждают в течение 2 ч до 5 С и добавляют охлажденную до 5 С фракцию Б в объеме, равном объему фракции А, причем вносят фракцию Б тремя равными частями через 10-15 мин, разбавленную сперму выдерживают 4 ч при 5 С, после чего замораживают. Состав для криоконсервирования спермы быка-производителя готовится следующим образом. Для получения фракции А готовят цитратный буфер на бидистиллированной воде 2,9 г натрия цитрата натрия вносят в мерную колбу вместимостью 100 г и добавляют 50-60 г воды, перемешивают до полного растворения с окончательным добавлением воды до метки. Далее отмеряют 3,58 г лактозы, 25 г желтка куриного яйца, вносят в раствор цитрата натрия и перемешивают для получения однородной массы раствора. Раствор подогревают до 30 С. Для получения фракции Б состава для криоконсервирования готовят цитратный буфер на бидистиллированной воде 2,4 г натрия цитрата натрия вносится в колбу и добавляется 82,5 г воды, перемешивают до полного растворения. Отмеряют 3,58 г лактозы, 25 г желтка куриного яйца, 17,5 г глицерина, вносят в раствор цитрата натрия и перемешивают для получения однородной массы раствора. Раствор охлаждают до 5 С. 2 12171 1 2009.08.30 Далее, в полученную свежую сперму вносят смесь антибиотиков, в состав которой входят тилозин - 0,5 г, гентамицин - 2,5 г, линко/спектин - 1,5-3,0 г, бидистиллированная вода - 95,5-94,0 г. Данный состав разбавляют фракциями А и Б нового состава. Способ криоконсервирования спермы быка осуществляют следующим образом. В спермоприемник вносят пипеточным дозатором смесь антибиотиков в количестве 0,02 мл раствора на каждый миллилитр спермы, выдерживают 5 минут при 30 С и оценивают подвижность сперматозоидов. Производят разбавление спермы фракцией А состава, для чего состав приливают аккуратно и медленно в спермоприемник (или по стенкам стеклянного смесителя со спермой) во избежание сильных отрицательных осмотических явлений из расчета, чтобы объем спермы и состава был наполовину запланированного объема разбавленной спермы (с учетом получения в одном миллилитре 200 миллионов сперматозоидов). Температура спермы и состава должна быть 30 С. Разбавленную фракцией А сперму помещают в холодильник, где она охлаждается в течение 2 ч до 5 С. Для того чтобы охлаждение проходило равномерно, колбу с разбавленной спермой помещают в стакан с водой, температура которой 30 С. Фракцию Б состава также помещают в холодильник, где она охлаждается до 5 С. В разбавленную фракцией А сперму вносят охлажденную фракцию Б в соотношении 11, при этом фракцию Б вносят не сразу, а делят на три равные части и прибавляют через 10-15-минутные интервалы медленно и постепенно. Этот этап разбавления производится в холодильнике при температуре 5 С на протяжении 30-45 мин. После финального разбавления в 1 мл разбавленной спермы должно содержаться 100 млн сперматозоидов. После завершения разбавления сперму расфасовывают в пайетты, которые размещают в планшеты. В каждой пайетте содержится 25 млн. сперматозоидов. Пайетты помещают в холодильник, выдерживают при температуре 5 С в течение 4 ч, замораживают и хранят в жидком азоте. После этого оттаивают и проверяют на подвижность, выживаемость, наличие патологических форм и повреждение акросомы и осеменяют животных общепринятыми методами. Пример. Для проверки эффективности способа был проведен сравнительный опыт по использованию двухфракционной (опыт) и стандартной (контроль) сред для замораживания спермы быков-производителей (табл. 1). Таблица 1 Показатели Замороженно-оттаянная сперма Подвижность сперматозоидов, баллов, контроль опыт Выживаемость спустя 5 ч, баллов, контроль опыт Патологические формы (контроль), всегов т. ч. первичные вторичные третичные Патологические формы (опыт), всегов т. ч. первичные вторичные третичные Сперматозоидов с повреждениями акросомы,контроль опыт 3 12171 1 2009.08.30 Подвижность сперматозоидов после выдержки спермы в течение 5 ч при температуре 38 С при использовании стандартной среды снизилась до 1,70,2 баллов, а новой среды только до 2,60,2 баллов. Различие по этому показателю достоверно (Р 0,05). Различия между опытными и контрольными образцами спермы по общему проценту патологических форм сперматозоидов, а также по частоте первичных, вторичных и третичных нарушений существенные (Р 0,05) в пользу новой среды. В образцах спермы с испытуемой средой меньше выявлялось и сперматозоидов с повреждениями акросомы. Различие по этому показателю также существенное (Р 0,05). В табл. 2 приведены данные по оплодотворяемости животных, осемененных спермой,замороженной новым способом. Таблица 2 Показатели Первое осеменение, всего в т.ч. плодотворное Оплодотворилось в среднем Третье осеменение, всего в т. ч. плодотворное Всего проведено осеменений в т.ч. плодотворных Опыт в том числе коров телок 82 29 63 21 76,8 72,4 1 1 1 100,0 5,9 73,3 1 1 84 30 64 22 76,1 73,3 Контроль в том числе коров телок 62 18 36 9 58,0 50,0 9 5 6 5 66,6 100,0 59,1 60,8 3 3 74 23 45 14 60,8 60,8 Следует отметить, что оплодотворяемость коров и телок в опытной группе была в среднем на 14,6 выше, чем в контрольной (соответственно 75,4 и 60,8 ). Различие характерно и для коров (76,1 и 60,8 ), и для телок (73,3 и 60,8 ). Особенно велика разница между группами была в оплодотворяемости после первого осеменения. В опытной группе она составила 75,6(76,8 и 72,4 для коров и телок) и 56,3 в контрольной (соответственно 58,0 и 50,0 ). Таким образом, использование для разбавления спермы опытной среды способствовало повышению ее качества после оттаивания и показателя оплодотворяемости после искусственного осеменения. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4