Способ подбора молочнокислых бактерий в состав заквасок для сыров

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ СПОСОБ ПОДБОРА МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ В СОСТАВ ЗАКВАСОК ДЛЯ СЫРОВ(71) Заявитель Могилевский технологический институт(73) Патентообладатель Могилевский технологический институт(57) 1. Способ подбора молочнокислых бактерий в состав заквасок для сыров, включающий определение протеолитической активности бактерий путем их культивирования в стерильном обезжиренном молоке при оптимальной температуре, осаждения белков из культуральной среды 10 -ной трихлоруксусной кислотой и определения в фильтрате количества в мгнизкомолекулярных продуктов гидролиза белка тирозина и триптофана, отличающийся тем, что протеолитическую активность определяют через 1-2 и 7-8 суток культивирования бактерий, а отбор бактерий в состав заквасок определяют по коэффициенту, 1-2 где ПА 7-8 - протеолитическая активность через 7-8 суток культивирования бактерий ПА 1-2 - протеолитическая активность через 1-2 суток культивирования бактерий. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в состав заквасок включают культуры молочнокислых бактерий, у которых протеолитическая активность через 1-2 суток культивирования равна или больше 3 мгтирозина и триптофана, а коэффициент равен или больше 2. Изобретение относится к области сыроделия, в частности к подбору молочнокислых бактерий по протеолитической активности в состав заквасок для производства сыров. 1470 1 Известен способ подбора молочнокислых бактерий в состав заквасок для производства сыров с учетом их протеолитической активности 1, включающий в себя использование в составе заквасок смеси культур молочнокислых бактерий с различным уровнем протеолитической активности. При этом обращают внимание на активность приклеточных протеиназ. Высокая их активность приводит к возникновению некоторых пороков сыра и снижению выхода готового продукта. Для разделения молочнокислых бактерий по признаку активности приклеточных протеиназ используют понятия протеиназо-отрицательных (с низкой активностью) и протеиназо-положительныхкультур(с высокой активностью приклеточных протеиназ). Включение в состав заквасок протеиназоположительных культур молочнокислых бактерий обусловлено необходимостью обеспечения нормального роста всех культур закваски. Это соотношение между протеиназо-положительными и протеиназо-отрицательными культурами молочнокислых бактерий подбирается экпериментально для производства конкретного вида сыра. Практически для выделения чистых культур бактерий с различным уровнем активности приклеточных протеиназ применяют имунную реакцию с использованием антител, полученных против очищенных препаратов приклеточных протеиназ. Недостатками этого метода является его высокая стоимость и трудоемкость, использование дорогостоящих реактивов и специального оборудования для обеспечения иммунологического анализа,необходимость выделения чистых препаратов приклеточных протеиназ, что требует больших затрат времени и высокой квалификации работников. Кроме того, в процессе селекции молочнокислых бактерий не исключена возможность присутствия у них новых видов приклеточных протеиназ, на которые еще не получены антитела, а также не установлена четкая зависимость между наличием конкретной протеиназы и качеством сыра. В составленных таким способом заквасках может изменяться соотношение молочнокислых бактерий с различным уровнем протеолитической активности в процессе их культивирования вследствие обмена генетической информацией и неравномерности роста, что в свою очередь может привести к возникновению вкусовых пороков сыра. Известен способ подбора культур молочнокислых бактерий в состав заквасок для сыров 2,включающий изучение общей степени протеолитической и, в частности, казеинолитической активности молочнокислых бактерий, а также глубины и ширины гидролиза казеина (казеинолиза). При этом протеолитические свойства молочнокислых бактерий исследуются по схеме, которая включает определение общей протеолитической активности молочнокислых бактерий на молочной и казеиновой средах определение общей степени казеинолиза в отношении накопления растворимых в воде общих азотистых веществ выявление особенности химизма казеинолиза в отношении образования из казеина растворимых в воде белковых веществ, не имеющих изоэлектрической точки, т.е. ширины казеинолиза определение глубины казеинолиза,т.е. накопления небелковых азотистых веществ определение качественного и количественного состава свободных аминокислот выявление специфики казеинолиза в отношении электрофоретических фракций казеина определение изменения химического состава, физико-химических и реологических свойств казеина в процессе казеинолиза. Недостатками предложенного способа является длительность и трудоемкость предлагаемых анализов. Кроме того, предлагаемый способ не содержит конкретных рекомендаций для подбора культур в состав заквасок, не установлена связь между изучаемыми характеристиками и качеством готового продукта. Из известных наиболее близким по технической сущности является способ подбора молочнокислых бактерий в состав заквасок для сыров 3,включающий определение протеолитической активности бактерий путем их культивирования в стерильном обезжиренном молоке при оптимальной температуре, осаждения белков из культуральной среды 10-ной трихлоруксусной кислотой и определения в фильтрате количества в мгнизкомолекулярных продуктов гидролиза белка тирозина и триптофана. Причем протеолитическую активность определяют через 3 суток культивирования. Известный способ прост в исполнении и доступен для массового тестирования культур. Также обосновано использование природной питательной среды - обезжиренного молока. Для сравнения культур по степени протеолитической активности условно принята градация слабые протеолиты активность до 3 мг , средние - от 3 до 6 мг ,сильные - свыше 6 мгтирозина и триптофана. В состав заквасок для сыров предлагается включать культуры молочнокислых бактерий, являющиеся сильными протеолитами через 3 суток культивирования. Однако данный способ не учитывает роль внутриклеточных и приклеточных протеаз молочнокислых бактерий заквасок в формировании органолептических показателей сыров в процессе созревания. Исходя из современных представлений о протеолитических системах молочнокислых бактерий, можно заключить, что определение протеолитической активности через 3 суток культивирования недостаточно для селекции молочнокислых бактерий, используемых в сыроделии. Известно,что приклеточные протеазы играют отрицательную роль в формировании вкусовых показателей сыра(возникновение порока горечь), а также могут быть причиной снижения выхода продукта. В то же время внутриклеточные протеазы (прежде всего пептидазы) способствуют образованию низкомоле 1470 1 кулярных продуктов распада казеина, что приводит к улучшению качества сыра. В связи с этим значение данного способа для селекции культур молочнокислых бактерий ограничено, поскольку он позволяет определить активность только приклеточных протеаз (3 суток культивирования) и не учитывает активность внутриклеточных протеаз. Поэтому не найдена зависимость между определяемой протеолитической активностью культур молочнокислых бактерий и способностью расщеплять горькие пептиды. Сыры, выработанные на культурах с высокой активностью приклеточных протеаз, зачастую имеют горький вкус. Задачей предлагаемого изобретения является устранение вкусовых пороков сыров, связанных с действием протеолитических ферментов (протеаз) молочнокислых бактерий. Поставленная задача достигается тем, что в способе подбора молочнокислых бактерий в состав заквасок для сыров, включающем определение протеолитической активности бактерий путем их культивирования в стерильном обезжиренном молоке при оптимальной температуре, осаждения белков из культуральной среды 10 -ной трихлоруксусной кислотой и определения в фильтрате количества в мгнизкомолекулярных продуктов гидролиза белка тирозина и триптофана, согласно изобретению протеолитическую активность определяют через 1-2 и 7-8 суток культивирования бактерий, а отбор бактерий в состав заквасок определяют по коэффициенту, 1-2 где ПА 7-8 - протеолитическая активность через 7-8 суток культивирования бактерий ПА 1-2- протеолитическая активность через 12 суток культивирования бактерий. В состав заквасок включают культуры молочнокислых бактерий, у которых протеолитическая активность через 1-2 суток культивирования равна или больше 3 мгтирозина и триптофана, а коэффициент равен или больше 2. Определение протеолитической активности культур молочнокислых бактерий на двух разных стадиях культивирования позволяет учесть в первом случае (-2 суток) преимущественно активность приклеточных протеаз, а во втором (7-8 суток) - внутриклеточных. Выбор интервалов времени определения протеолитической активности объясняется доступностью белков молока для различных ферментов протеолитических систем молочнокислых бактерий. В первые 1-2 суток лизис клеток молочнокислых бактерий при культивировании на обезжиренном молоке происходит в незначительной степени и определяемая ПА 1-2, в основном, обусловлена действием приклеточных протеаз. При дальнейшем культивировании лизис клеток достигает значительной степени, и происхо дит освобождение внутриклеточных протеаз, что вновь приводит к увеличению протеолитической активности. Характерная форма кривых изменения протеолитической активности во времени, полученная для большинства исследуемых молочнокислых культур, представлена на фиг. на примере трех штаммов видов .. , .., ... . Из фиг. видно, что первоначально протеолитическая активность возрастает до двух суток, затем концентрация продуктов протеолиза не изменяется или даже уменьшается, а после 3 суток культивирования наблюдается дальнейший рост протеолитической активности. Первоначальное увеличение продуктов протеолиза связано, в основном, с действием приклеточных протеаз. Дальнейший спад или задержка увеличения концентрации продуктов протеолиза объясняется прекращением роста клеток в результате ингибирующего действия продуктов брожения. После 3 суток культивирования спад прекращается и начинается увеличение концентрации продуктов протеолиза, что объясняется действием внутриклеточных протеаз, освобождающихся при лизисе бактериальных клеток. К 7-8 суткам культивирования увеличение концентрации продуктов протеолиза замедляется. Полученные данные позволяют заключить, что измерение протеолитической активности молочнокислых бактерий в культуральной среде на 1-2 сутки отображает активность прежде всего приклеточных протеаз, а на 7-8 сутки - внутриклеточных. Определение протеолитической активности через интервал времени менее 1 суток нецелесообразно, так как в данном случае приклеточные протеазы еще не успевают полностью проявить свою активность и протеолитическая активность продолжает нарастать до 2 суток культивирования. Через 2 суток наблюдается максимум концентрации продуктов протеолиза, происходящего под действием приклеточных протеаз, а содержание живых клеток после 2 суток снижается. Это свидетельствует о том, что нецелесообразно активность приклеточных протеаз учитывать через временной интервал свыше 2 суток. Культивирование молочнокислых бактерий менее 7 суток и определение при этом протеолитической активности недостаточно для учета активности внутриклеточных протеаз, так как к этому времени происходит неполный лизис бактериальных клеток, и не все внутриклеточные ферменты активируются. Свыше 8 суток культивирования протеолитическая активность молочнокислых бактерий возрастает в очень незначительной степени. Поэтому определение протеолитической активности молочнокислых бактерий через 7-8 суток культивирования является достаточным для определения активности внутриклеточных протеаз и позволяет не слишком растягивать анализ во времени. Таким образом, определение протеолитической активности молочнокислых 1470 1 бактерий через 1-2 и 7-8 суток их культивирования в обезжиренном стерильном молоке и нахождение их отношения (К) позволяет учитывать соотношение активностей внутри- и приклеточных протеаз молочнокислых бактерий, что, в свою очередь, при выдерживании определенных значений К устраняет возможность получения сыра с вкусовыми пороками (прежде всего - горечью), связанными с действием протеолитических ферментов молочнокислых бактерий. Значение коэффициента К не зависит от того,относится ли культура к сильным или слабым протеолитам, т.е. он не характеризует абсолютное количество активных ферментов на поверхности и внутри клетки, а только их соотношение. Опытные выработки сыра показали, что включение в состав закваски культур молочнокислых бактерий, имеющих значения ПА 1-23 мгтирозина и триптофана, а К 2, достаточно, чтобы получить сыр с высокими органолептическими показателями. Однако, чем выше будет значение коэффициента К,тем это благоприятнее для сыроделия, так как это свидетельствует о том, что культура имеет высокую активность внутриклеточных протеаз и достаточно низкую - приклеточных, что позволяет избежать вкусовых пороков сыров, связанных с действием протеаз молочнокислых бактерий. Нецелесообразно включать в состав заквасок культуры молочнокислых бактерий, имеющие значение ПА 1-2 меньше 3 мг тирозина и триптофана даже при условии К больше 2, так как они имеют слишком слабую активность приклеточных протеаз, что препятствует нормальному развитию культур закваски в молоке, замедляя их рост. Если культуры показывают значение ПА 1-2 меньше 3 мгтирозина и триптофана, а К меньше или равен 2,то это свидетельствует о том, что они в целом протеолитически малоактивны (имеют низкую активность и приклеточных, и внутриклеточных протеаз), что приводит к замедлению процесса созревания сыра и снижению его качества. Культуры, показывающие значение ПА 1-2 больше или равно 3 мгтирозина и триптофана, но имеющие значение коэффициента К меньше 2, обладают достаточно высокой активностью приклеточных протеаз и слабой внутриклеточных, что отрицательно сказывается на вкусовых показателях (появление горечи) и выходе сыра. Таким образом, при подборе культур молочнокислых бактерий в состав заквасок для сыров по протеолитической активности, необходимо отбирать такие , у которых протеолитическая активность через 1-2 суток культивирования равна или больше 3 мгтирозина и триптофана, а коэффициент равен или больше 2. Примеры подбора культур молочнокислых бактерий в состав заквасок для сыров по предлагаемому способу приведены в таблице. Пример 1. Культуру ..7 засевают в стерильное обезжиренное молоко и термостатируют при 30 С. Через 1 сутки и 7 суток производят отбор проб и определяют протеолитическую активность. Для чего к 3 мл культуры добавляют 2 мл дистиллированной воды и 10 мл 10-ной трихлоруксусной кислоты, выдерживают в течение 10 минут, фильтруют, отбирают 5 мл фильтрата в мерную колбу емкостью 50 мл, добавляют 10 мл 13 -ного раствора карбоната натрия и 2 мл фенольного реактива Фолина-Циокальто. Содержимое колбы доводят водой до метки, перемешивают, выдерживают в течение 45 минут, замеряют оптическую плотность при длине волны 650 нм против фильтрата молока (той же партии),обработанного по указанному способу, и пересчитывают показания оптической плотности на содержание тирозина и триптофана в мгпо калибровочному графику. Исследуемая культура через 1 сутки культивирования имеет значение протеолитической активности ПА 16,3 мгтирозина и триптофана, а через 7 суток ПА 710,3 мгтирозина и триптофана. Рассчитывают коэффициент отбора культур в состав заквасок ПА 710,31,63 К ПА 6,3 1 Данную культуру нецелесообразно включать в состав заквасок для сыров по протеолитической активности, так как она имеет неблагоприятное для сыроделия соотношение внутри- и приклеточных протеаз (К меньше 2), что приводит к малой способности культуры расщеплять горькие пептиды. В результате сыры, выработанные с использованием данной культуры, имеют горький вкус. Пример 2. Культуру ..19 засевают в стерильное обезжиренное молоко и термостатируют при 30 С. Через 1,5 суток и 7,5 суток производят отбор проб и определяют протеолитическую активность согласно описанному выше способу. Исследуемая культура через 1,5 суток культивирования имеет значение протеолитической активности ПА 1,54,5 мгтирозина и триптофана, а через 7,5 суток ПА 7,510,7 мгтирозина и триптофана. Рассчитывают коэффициент отбора культур в состав закваск ПА 7,5 10,7 К 2,38 ПА 4,5 1,5 Данную культуру по протеолитической активности необходимо включать в состав заквасок для производства сыров, так как она имеет значение протеолитической активности через 1,5 суток культивирования больше 3 мгтирозина и триптофана и благоприятное для сыроделия соотношение внутри - и приклеточных протеаз в (К больше 2). В результате сыры, выработанные с использованием данной культуры имеют высокие органолептические показатели. 1470 1 Пример 3. Культуру ..13 засевают в стерильное обезжиренное молоко и термостатируют при 30 С . Через 2 суток и 8 суток производят отбор проб и определяют протеолитическую активность согласно описанному выше способу. Исследуемая культура через 2 суток культивирования имеет значение протеолитической активности ПА 21 мгтирозина и триптофана, а через 8 суток ПА 82,7 мгтирозина и триптофана. Рассчитывают коэффициент отбора культур в состав заквасок ПА 82,72,7 К ПА 1,0 2 Вид бактерий Куль- ПА, мгтиртри через тураДанная культура имеет благоприятное для сыроделия соотношение внутри- и приклеточных протеаз(К больше 2), однако ее нецелесообразно включать в состав заквасок, так как она малоактивна (ПА 2 меньше 3 мгтирозина и триптофана). В результате использование данной культуры при производстве сыра приводит к замедлению процесса созревания сыра и ухудшению его вкуса (появление горечи). Коэффи- Вкус сыра циент отбора, К в закваску не включать в закваску не включать вкус ПА 1-2 меньше в закваску не слабо 3 мгвключать выражен- К меньше 2 ный, слабая горечь 1470 1 Редактор В.Н. Позняк Корректор Т.Н. Никитина Заказ 2255 Тираж 20 зкз. Государственное патентное ведомство Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.