Штамм бифидобактерий Bifidobacterium adolescentis, устойчивый к низким значениям pH, для получения пробиотического препарата или кисломолочного продукта

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ, УСТОЙЧИВЫЙ К НИЗКИМ ЗНАЧЕНИЯМ ,ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ИЛИ КИСЛОМОЛОЧНОГО ПРОДУКТА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Сидоренко Анастасия Вячеславовна Новик Галина Ивановна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(56)863639, 1981.2261908 1, 2005.2260042 2, 2005. ЩЕТКО В.А. Бактериоцины-42 и 791 биосинтез и свойства. Автореферат диссертации. Минск, 2007. - С. 3-7, 14-16. НОВИК Г.И. и др. Микробные биотехнологии фундаментальные и прикладные аспекты Сб. научн. трудов. Т. 1. - Минск, 2007. - С. 305-313... 2007. - . 103. - . 4. - . 1147-1157.(57) Штамм бифидобактерийБИМ В-462-Д, устойчивый к низким значениям , для получения пробиотического препарата или кисломолочного продукта. Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и представляет собой штамм бифидобактерий, устойчивый к низким значениям ,для получения пробиотического препарата или кисломолочного продукта. Бактерии родаявляются основой моно- и поликомпонентных пробиотических препаратов и продуктов функционального питания, предназначенных для лечения и профилактики дисбиотических состояний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ),стимуляции иммунной системы, нормализации обмена веществ 1, 2, 3. Данные многочисленных исследований свидетельствуют, что позитивное действие на организм человека оказывают жизнеспособные, метаболически активные штаммы , а эффективность бифидосодержащих пробиотиков и продуктов питания зависит от содержащегося в них количества жизнеспособных клеток бифидобактерий 1, 3, 4, 5. Бактерии родав процессе жизнедеятельности образуют органические кислоты, что приводит к постепенному снижениюсреды и ингибированию развития самих микроорганизмов. Кроме того, высокая кислотность среды, возникающая в результате накопления в ней конечных продуктов метаболизма (молочной и уксусной кислот),является причиной быстрой потери жизнеспособности бифидобактерий при хранении. Согласно литературным данным, титр клеток бифидобактерий в течение 1-2 недель хранения 16449 1 2012.10.30 в питательной среде при 4 С может снижаться на несколько порядков 1, 2, 5, 6. Одним из способов повышения жизнеспособности бифидобактерий в процессе хранения является коррекция активной кислотности среды до 7,0 10 раствором соды. Однако нейтрализация среды 10 раствором 3 - трудоемкий процесс, повышающий вероятность контаминации культуры. Низкие значенияферментированных молочных продуктов основная причина быстрого снижения титра жизнеспособных клеток бифидобактерий,входящих в их состав, даже при соблюдении условий и сроков хранения 1, 5, 7, 8. Высокая кислотность желудочного сока (кислотный стресс) является наиболее повреждающим фактором ЖКТ, приводящим к существенной потере жизнеспособности пробиотических штаммов 1, 4, 9, 10. Учитывая вышеизложенное, важным свойством производственных штаммов бифидобактерий является устойчивость к низким значениям(кислотоустойчивость) 1, 4, 10. Поскольку бифидобактерии, выделенные из природных источников, чувствительны к низким значениям , перспективным направлением является улучшение биотехнологически ценных свойств изолированных и поддерживаемых в коллекциях штаммов путем их целенаправленной селекции по признаку кислотоустойчивости 5, 11. Известны штаммы бифидобактерий 1 12 и 791 13, которые используются для производства пробиотических препаратов и кисломолочных продуктов. Недостатками этих штаммов являются низкая протеолитическая активность, медленное развитие в молоке без ростовых факторов, высокая чувствительность к стрессовым факторам (низкие значения , доступ кислорода). Медленное развитие в молоке затрудняет использование вышеназванных культур в качестве основы кисломолочных продуктов. Низкая устойчивость к неблагоприятным внешним факторам приводит к значительной потере жизнеспособности и биологической активности бифидобактерий в процессе хранения пробиотиков и продуктов питания, а также при прохождении через желудочно-кишечный тракт. Наиболее близким из аналогов заявляемого изобретения является штамм-42 14 (прототип), используемый при производстве фармакопейного пробиотического препарата Бифидин и ряда кисломолочных продуктов. Штамм-42 характеризуется высокой антагонистической активностью, устойчивостью к терапевтическим дозам антибиотиков, используемых в медицинской практике, активным ростом и кислотообразованием в молоке и питательных средах. Недостатками данного штамма являются чувствительность к кислотному стрессу и действию низких значенийпри хранении в сквашенном молоке и питательных средах без нейтрализации. Низкая кислотоустойчивость-42 снижает позитивное действие пробиотиков и продуктов питания, созданных на основе этой культуры, а также затрудняет использование штамма при производстве пробиотиков и продуктов питания с длительным сроком хранения. Целью изобретения является получение нового штамма бифидобактерийБИМ В-462-Д, устойчивого к низким значениямжелудочного сока,сохраняющего жизнеспособность при хранении в сквашенном молоке и питательных средах без нейтрализации, способного развиваться при низких значенияхсреды культивирования. Для получения штаммаБИМ В-462-Д была проведена селекция музейного штамма-42. Селекция проводилась без использования мутагенных факторов и генно-инженерных методов посредством длительной адаптации штамма к низким значениямсреды культивирования с последующим отбором клонов, устойчивых к кислотному стрессу. Для культивирования бифидобактерий использовали среду де Мана 15 с -цистеин-гидрохлоридом (МРС-Б) (г/л пептон - 10,0 мясной экстракт - 10,0 дрожжевой экстракт - 5,0 лактоза - 10,0 глюкоза -10,0 24 - 2,0 аммоний лимоннокислый - 2,0 натрий уксуснокислый - 5,0 472 - 0,4 2 16449 1 2012.10.30 452 - 0,08 -цистеин- - 0,5 твин-80 - 1,0 агар - 1,0). Бактерии выращивали при температуре 371 С в течение 18-24 ч. Начинали адаптацию культивированием бифидобактерий при 5,5, постепенно снижая значениесреды культивирования на 0,2-0,3 единицы до 4,0 с регулярной проверкой устойчивости бифидобактерий к кислотному стрессу. Кислотный стресс моделировали путем инкубации бифидобактерий в 0,5,2,0, при 37 С в течение 120-180 мин 9. Адаптацию проводили в течение 6 месяцев при периодичности пересевов 1-2 раза в неделю (в зависимости от показателей накопления биомассы и титра клеток). В результате селекции получен новый кислотоустойчивый штамм бифидобактерийБИМ В-462-Д, сохраняющий исходный титр жизнеспособных клеток в течение 180 мин инкубации при 2,0 в течение 24 суток хранения при 4 С в сквашенном молоке и 72 суток хранения в питательной среде без нейтрализации, способный к росту при низких значенияхсреды культивирования. Приобретенные признаки сохранялись при поддержании штамма на питательной среде МРС-Б ( 5,0) при длительном (более 24 месяцев) хранении. Заявляемый штамм депонирован в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов (Научная коллекция типовых и промышленно-ценных непатогенных микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси). Таксономическая принадлежность. Штамм был идентифицирован какпо совокупности морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков. Культурально-морфологические признаки. При посеве в полужидкие (0,2 агара) среды штамм образует белые колонии в виде гречишных зерен или гвоздиков диаметром 1-3 мм. При глубинном культивировании в жидких питательных средах отмечается рост по всей толщине столбика среды за исключением зоны аэробиоза (0,5 см). КлеткиБИМ В-462-Д представляют собой грамположительные прямые палочки с утолщениями на концах, неспорообразующие, неподвижные. Расположение клеток в мазке парное, - или -образное, реже одиночное. Физиолого-биохимические признаки. Факультативный анаэроб. Каталазу не образует,желатин не разжижает, нитраты не восстанавливает. Ферментирует глюкозу, лактозу, галактозу, ксилозу, маннозу, мальтозу, целлобиозу, арабинозу (медленно). Сахарозу, манних, сорбит не утилизирует. Глюкозу ферментирует с образованием молочной и уксусной кислот, без продукции газа. Пигмент не образует. Оптимальная температура роста 371 С, оптимум- 5,00,2. Развитие периодической культурыБИМ В-462-Д в среде МРС-Б характеризуется непродолжительной лаг-фазой (3 ч) и длительной стадией экспоненциального роста (12-15 ч). Максимальный титр клеток (4-8109 КОЕ/мл), показатели накопления биомассы (ОП 600 2,504-2,534) и активной кислотности ( 4,150,15) регистрируются через 24 часа культивирования. При хранении в питательной среде без нейтрализации (4 С) титр жизнеспособных клетокБИМ В-462-Д достоверно не изменяется в течение 5 недель, после чего снижается на порядок. Для сравнения, титр жизнеспособных клеток штамма-прототипа снижается на два порядка(с 2-3109 КОЕ/мл до 1-2107 КОЕ/мл) в течение 35 суток хранения. При внесении 5 об.инокулята штамм сквашивает стерильное обезжиренное молоко через 10-12 ч культивирования с образованием нежного однородного сгустка без отделения сыворотки. Титр клеток и показатель активной кислотности на момент образования сгустка составляют 1-3108 КОЕ/мл и 4,00,2 соответственно. При хранении в сквашенном молоке (4 С) титр жизнеспособных клетокБИМ В-462-Д достоверно не изменяется в течение 24 суток, в то время как количество жизнеспособных клеток штамма-прототипа снижается более чем на три порядка (с 2-3109 КОЕ/мл до 7-9104 КОЕ/мл). 3 16449 1 2012.10.30 Заявляемый штамм характеризуется высоким уровнем продукции внеклеточных протеолитических ферментов - 216,26.1 ед/мл. Активность ассоциированной с клеткой В-галактозидазы варьируется от 0,2650,021 ед/мл (при выращивании в среде с глюкозой) до 0,4720,027 ед/мл (при выращивании в среде с лактозой). ШтаммБИМ В-462-Д характеризуется более высокими, по сравнению со штаммом-прототипом, коэффициентами гидрофобности и способности клеток к аутоагрегации (табл. 1). Таблица 1 Характеристика гидрофобности и способности к аутоагрегации клеток бифидобактерий Штамм 0 ч 1 ч 2 ч 3 ч В.БИМ В-462-Д 37,73,3 0 5,50,5 7,40,2 14,40,9 В.-42 24,93,9 0 3,01,0 6,10,6 7,61,2 Примечание- коэффициент гидрофобности поверхности клетки- коэффициент, характеризующий способность клеток к аутоаггрегации. Молекулярно-биологические признаки. Штамм не содержит экстрахромосомной (плазмидной) ДНК. Маркерными признаками, отличающими штаммБИМ В-462-Д от штамма-прототипа-42, являются способность к росту при низких значенияхпитательной среды (оптимум 5,00,2, для штамма-прототипа - 7,00,2) способность сохранять высокий титр жизнеспособных клеток при хранении (4 С) в сквашенном молоке и питательной среде без нейтрализации в течение 24 и 72 суток соответственно устойчивость к кислотному стрессу. Биотехнологическая характеристика. Технологичность заявляемого штамма обусловлена его способностью расти при низких значенияхсреды культивирования (фигура), в течение длительного времени сохранять жизнеспособность при хранении в сквашенном молоке и питательных средах без нейтрализации, высокой устойчивостью к кислотному и тепловому стрессам (табл. 2). Таблица 2 Устойчивость бифидобактерий к кислотному и тепловому стрессам Штамм / титр клеток, КОЕ/мл В.БИМ В-462-Д В.-42 Как видно из данных, представленных на фигуре, показатели накопления биомассы и титра жизнеспособных клеток, полученные при культивировании .БИМ В-462-Д в среде МРС-Б при 5,0 были незначительно выше, чем показатели, полученные при выращивании этого штамма при 6,8. Исходный штамм .-42 характеризовался слабым ростом при 5,0. Способность к росту при низких значенияхсреды культивирования является уникальным свойством заявляемого штамма, не характерным для культур бифидобактерий, выделенных из природных источников. Стабильность сохранения полезного свойства. Приобретенные признаки сохранялись при поддержании штамма на питательной среде МРС-Б ( 5,0) при длительном (более 24 месяцев) хранении. 16449 1 2012.10.30 Заявляемый штаммБИМ В-462-Д устойчив к хлорамфениколу, линкомицину, цефалексину, фурадонину, чувствителен к ампициллину, эритромицину, доксициклину (табл. 3). Таблица 3 Сравнительная характеристика антибиотикоустойчивости бифидобактерий Антибиотик/ МИК, Ампи- Цефа- Эритро- Хлораммкг/мл циллин лексин мицин феникол.БИМ В-447 и .БИМ В-169 (табл. 4). Таблица 4 Антагонистическая активность бифидобактерий В. В. Тест-культура/ . БИМ БИМ задержки БИМ БИМ БИМ БИМ В-238 В-379 роста, мм В-108 В-169 В-25 В-276 БИМ БИМ БИМ В-157 В-246 В-447 Примечание- отсутствие зоны подавления роста тест-культуры. Штамм непатогенен, нетоксигенен. Сведения о консервации штамма. Лиофилизация. Лиофилизации подвергают физиологически активную культуру.БИМ В-462-Д. Штамм выращивают в питательной среде МРС-Б при 37 С в течение 18-20 ч (до достижения ранней стационарной стадии роста). Клетки осаждают центрифугированием (10 000 об/мин, 10 мин), отмывают от ростовой среды, ресуспендируют в криозащитной среде (2/3 от исходного объема культуры). В качестве криозащитной среды используют стерильное обезжиренное молоко (10 обсухих веществ). Полученную суспензию асептически разливают по 0.2 мл в стерильные ампулы для лиофилизации,замораживают до -50-55 С, высушивают из замороженного состояния под вакуумом при-55 С в течение 5 ч, после чего дополнительно досушивают под вакуумом при 20 С в течение 2,5 ч. Количество жизнеспособных клеток в содержимом ампулы составляет 7-9108 КОЕ. Ампулы с лиофильно-высушенной культурой хранят при 4 С. Криоконсервация. Криоконсервации подвергают физиологически активную культуру .БИМ В 462-Д. Штамм выращивают в питательной среде МРС-Б при 37 С в течение 18-20 часов(до достижения ранней стационарной стадии роста). Клетки осаждают центрифугированием(10 000 об/мин, 10 мин), отмывают от ростовой среды, ресуспендируют в криозащитной среде (1/3 от исходного объема культуры). В качестве криозащитной среды используют стерильную питательную среду МРС-Б. Полученную суспензию асептически разливают по 1 мл в стерильные криопробирки и замораживают при -70 С или -196 С. Титр клеток в содержимом криопробирки составляет 2-4109 КОЕ/мл. Криопробирки с замороженной культурой хранят при -70 С. 5 16449 1 2012.10.30 Технологичность и уникальные свойства заявляемого штамма наглядно иллюстрируют следующие примеры. Пример 1. Хранение бифидобактерий в питательной среде без нейтрализации. Бифидобактерии в количестве 5 об.инокулируют в жидкую среду МРС-Б и выращивают при 37 С в течение 20-24 ч (до достижения стационарной стадии роста). Показатели накопления биомассы и титра клеток заявляемого штамма через 24 ч культивирования составляют ОП 6002,504-2,534 и 4-8109 КОЕ/мл, соответственно, штамма-прототипа ОП 6002,498-2,513 и 3-6109 КОЕ/мл. Пробирки с выросшей культурой помещают на хранение в холодильник (4 С). Жизнеспособность бифидобактерий оценивают через каждые 7-14 суток в течение 10 недель хранения. Титр жизнеспособных клетокБИМ В-462-Д достоверно не изменяется в течение 5 недель хранения,после чего снижается на порядок (табл. 5). Титр жизнеспособных клеток штаммапрототипа снижается на два порядка в течение 35 суток хранения, а через 72 суток хранения - на 5 порядков (табл. 5). Таблица 5 Жизнеспособность бифидобактерий при хранении в питательной среде (4 С) Продолжительность хранения, сутки / титр клеток, КОЕ/мл 0 14 28 35 42 56 72 Пример 2. Сохранность бифидобактерий в сквашенном молоке. Бифидобактерии в количестве 5 об.инокулируют в стерильное обезжиренное молоко без ростовых факторов. Культивируют при 371 С в течение 12-14 часов. Штамм .БИМ В-462-Д сквашивает молоко через 10-12 ч при титре клеток 1-3108 КОЕ/мл и 4,00,2 ед. Штамм-прототип сквашивает стерильное молоко за 12-14 ч культивирования при титре клеток 2-3108 КОЕ/мл и 3,90,2 ед. После образования сгустка пробирки со сквашенным молоком достают из термостата, охлаждают и хранят в холодильнике при 4 С. Титр жизнеспособных клеток заявляемого штамма в течение 24 суток хранения достоверно не изменяется, а титр клеток штамма-прототипа снижается на 4 порядка (табл. 6). Таблица 6 Жизнеспособность бифидобактерий при хранении в сквашенном молоке Продолжительность хранения, сутки /титр клеток, КОЕ/мл 0 7 12 18 24 8 8 7 Данные, приведенные в примерах 1 и 2, свидетельствуют о высокой устойчивости заявляемого штамма к низким значениями его перспективности для использования при производстве жидких пробиотиков и бифидосодержащих кисломолочных продуктов с длительным сроком хранения. Пример 3. Определение устойчивости бифидобактерий к кислотному стрессу. 1 мл 18-часовой культуры бифидобактерий, выращенной в жидкой среде МРС-Б при 37 С, осаждают центрифугированием (8 мин, 10 000 об/мин). Клеточный осадок дважды промывают равным объемом физиологического раствора и ресуспендируют в 10 мл 5 16449 1 2012.10.30 180 мин, после чего определяют количество жизнеспособных клеток бифидобактерий и их биологические свойства. Заявляемый штамм бифидобактерий сохранял исходную жизнеспособность и физиологическую активность через 180 мин инкубации при 2,0 (табл. 7). Титр жизнеспособных клеток и физиологическая активность штамма-прототипа существенно снижались(табл. 7) Таблица 7 Влияние кислотного стресса на жизнеспособность и физиологическую активность бифидобактерий Штамм.МС-42 1. Титр жизнеспособных клеток при инкубации при 2.0 0 мин 1,51,0109 КОЕ/мл 1,3 1,0109 КОЕ/мл 180 мин 6,32,3108 КОЕ/мл 5,72,5105 КОЕ/мл 2. Рост и кислотообразование в питательных средах после инкубации при 2.0 биомасса, ОП 600 2,234-2,375 0,848-0,957 9 титр клеток, КОЕ/мл 1-310 7-9107 кислотность,4,15-4,23 4,65-4,92 3. Рост и кислотообразование в молоке после инкубации при 2.0 время образования сгустка, ч 11-12 без сгустка 7 титр клеток, КОЕ/мл 9-1210 3-5106 кислотность,3,8-4,2 5,7-6,0 4. Антагонистическая активность после инкубации при 2.0.БИМ В-447 Примечание - - отсутствие зоны подавления роста тест-культуры. Данные, приведенные в примере 3, свидетельствуют о высокой устойчивости заявляемого штамма к кислотному стрессу и его перспективности для использования в качестве основы пробиотических препаратов, предназначенных для лечения и профилактики дисбиотических состояний ЖКТ. Таким образом, заявляемый штамм бифидобактерий по сравнению со штаммомпрототипом имеет следующие преимущества способность к развитию при низких значенияхсреды культивирования способность сохранять высокий титр жизнеспособных клеток при хранении при 4 С в сквашенном молоке и питательной среде без нейтрализации устойчивость к кислотному стрессу. Перечисленные свойства, а также высокая антагонистическая активность и отсутствие в клетках экстрахромосомной ДНК делают штамм биотехнологически ценным. Заявляемый штамм является перспективным для производства пробиотических препаратов и диетических кисломолочных продуктов. 16449 1 2012.10.30 Источники информации 1. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. ТомПробиотики и функциональное питание. - М. ГРАНТЪ, 2001. - 288 с. 2.,//. - 1999. - . 19. - . 10. - . 1559-1597. 3.,,,.// . . . - 2005. - . 98. - . 1303-1315. 4.,.// . . 2000. - . 130. - . 391-395. 5.,,,// . .. - 1999. - . 47. - . 25-32. 6.В.,... ./ . .. 3- .. - 2006. . 322-382. 7..// . 2005. - . 85. - . 39-56. 8.,,,.// .. - 2000. - . 63. - . 3296-3306. 9.,,.,// . . . - 1998. . 84. - . 759-768. 10..,.,.,.,.// .. - 2007. - . 90. - . 8. - . 3572-3578. 11.., - .-.,.,..// Динамика развития .БИМ В-462-Д и .МС-42 при глубинном культивировании в среде МРС-Б при 6,8 и 5,0 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 9