Штамм бифидобактерий Bifidobacterium adolescentis БИМ В-456 Д для получения пробиотического препарата или закваски

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ШТАММ БИФИДОБАКТЕРИЙБИМ В-456 Д ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ИЛИ ЗАКВАСКИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Щетко Виталий Анатольевич Головнева Наталья Алексеевна Рябая Наталья Евгеньевна Грель Мария Викторовна Самарцев Андрей Анатольевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси- С. 3-5, 14-16. НОВИК Г.И. и др. Микробные биотехнологии фундаментальные и прикладные аспекты Сб. научн. трудов. Т.1. - Минск, 2007. - С. 305-313.(57) Штамм бифидобактерийБИМ В-456 Д для получения пробиотического препарата или закваски. Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии, микробиологической промышленности, ветеринарии и касается нового штамма бифидобактерий, который может быть использован для получения пробиотических препаратов или заквасок. Бактерии .входят в состав различных лечебно-профилактических препаратов-пробиотиков, применяемых в сельском хозяйстве и медицине 1. В механизме антагонистической активности бифидобактерий большое значение придается продукции органических кислот, оказывающих ингибирующий эффект на гнилостную и патогенную микрофлору кишечника. Известно, что многие штаммы бифидобактерий являются антагонистами сальмонелл, а также ингибируют рост бактерий родов , ., , , , , , 2, 3. Однако высокую активность кислотообразования, являющуюся общим биологическим признаком рода бифидобактерий, не всегда правомерно идентифицировать с их антагонистической активностью, т.к. культуры с выраженной активностью кислотообразования могут проявлять себя как слабые антагонисты, а среди антагонистически активных бифидобактерий встречаются слабые кислотообразователи. Результаты некоторых исследова 13853 1 2010.12.30 ний 4, 5 показали, что антагонистическая активность в ряде случаев может быть обусловлена продукцией бактериоцинов и бактериоцинподобных соединений. В настоящий момент разработан ряд моно- и поликомпонентных бактериальных препаратов и продуктов на основе различных штаммов бифидобактерий 2261904 1,2314337 1,863639 1,2120991 1,2048517 1,2261909 С 1,1050 1,патент США 5922375, патент США 5902743, патент США 6746672, патент США 7427499,патент Япония 6063935, патент Франция 2411008. Недостатками данных препаратов и продуктов являются быстрая элиминация нежизнеспособных лиофилизированных клеток, отсутствие толерантности у некоторых штаммов пробиотических микроорганизмов к воздействию желчных кислот, высокой кислотности среды и другим факторам. Более того, при попадании в желудочно-кишечный тракт активизируется лишь 5 бактерий, представляющих основу пробиотика. Высокая себестоимость также ограничивает их применение. Наиболее близким заявляемому штамму по технической сущности и достигаемому результату является штаммДВА-5 6. Данный штамм, выбранный в качестве прототипа заявляемого штамма, может быть использован при производстве ферментированных пищевых продуктов, неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок к пище, гигиенических и косметических средств. ШтаммДВА-5 обладает биологически и технологически значимыми свойствами, такими как кислотообразующая активность, способность наращивать микробную биомассу на различных питательных средах. Штамм антагонистически активен по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Однако недостатком этого штамма, принятого за прототип, является отсутствие бактериоцинпродукции, играющей важную роль в антагонистической активности бифидобактерий. Задачей данного изобретения является получение нового штаммаБИМ В-456 Д, обладающего признаком бактериоцинпродукции, высокой антимикробной активностью, что обеспечивает получение пробиотических препаратов на его основе с высокими лечебно-профилактическими свойствами. Новый штаммБИМ В-456 Д получен из В.-42 методом индуцированного мутагенеза по признаку повышенной бактериоцинпродукции и депонирован в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов Института микробиологииБеларуси. Штамм непатогенен и нетоксичен. Полученный штамм характеризуется следующими признаками. Физиолого-биохимические особенности штамма. Клетки каталазо-отрицательные, нитраты не восстанавливают, желатин не разжижают,пигмент не образуют. Ферментируют арабинозу, галактозу, глюкозу, лактозу, лактулозу,мальтозу, мелецитозу, раффинозу, сахарозу, рибозу без образования газа. Глюкозу сбраживают до уксусной, молочной кислот и этанола. Не утилизируют сорбит, целлобиозу,маннит, крахмал, салицин. Оптимум температурного роста 371 С. Пределы температуры роста 30-42 С. Оптимум рН - 7,0-7,5. Пределы рН 4,0-8,0. Культурально-морфологические особенности штамма. Короткие, прямые или разветвленные палочки с булавовидными утолщениями на концах, грамположительные, некислотоустойчивые, неподвижные, спор не образуют. Анаэробы. При глубинном посеве в полужидкую питательную среду образуют поверхностную стерильную зону 0,5-1,0 см. При посеве последовательных разведений культуры образуют отдельные колонии в виде чечевичек или комет. При анаэробном выращивании на плотных питательных средах образуются круглые,гладкие, однородно кремовые или белые непрозрачные пастообразные -3 мм колонии с ровными краями. 2 13853 1 2010.12.30 Область применения штамма. Наличие у штаммаБИМ В-456 Д признака повышенной бактериоцинпродукции, выраженной антагонистической активности к патогенным и условнопатогенным микроорганизмам, дает возможность отнести штамм к промышленно ценным микроорганизмам для создания пробиотических препаратов. Активность (продуктивность) штамма, другие производственные показатели. Штамм характеризуется стабильным признаком продукции бактериоцинов, которые подавляют рост широкого круга патогенных и условнопатогенных бактерий, активно растет на стандартных питательных средах. Способ определения активности штамма с указанием метода. Активность штамма по отношению к патогенным и условнопатогенным микроорганизмам определяют методом лунок. В чашки заливают 30 мл расплавленной среды с 2 агар-агара, в 10 мл предварительно расплавленной и охлажденной среды с 1 агара вносят клетки тест-штамма и наслаивают на застывшую в чашке Петри среду. Затем с помощью сверла делают лунки диаметром 6 мм, в которые вносят по 100 мкл супернатанта культуральной жидкостиБИМ В-456 Д, нейтрализованной до рН 7,0. Чашки инкубируют в термостате при температуре, наиболее благоприятной для роста тест-штаммов. Через 24 час измеряют зоны задержки роста, образовавшиеся вокруг лунок. Антагонистическую активность бактериоцинов выражают в условных единицах. За 1 ед. принимают такое количество бактериоцинов, которое обеспечивает 0,1 мм зоны задержки роста тест-штамма. Продуцирующую способность клеток выражают в единицах на мг биомассы бифидобактерий (ед/мг). Способ, условия и состав среды для длительного хранения штамма. Состав среды (г/л) лактоза - 10, дрожжевой экстракт - 5, пептон - 10, мясо-пептонный бульон - 100, 242 - 2, 4 - 0,2, 442 - 0,05,- 0,5, аммония цитрат 3-х водн. - 3, цистеин гидрохлорид - 0,2, агар - 1, 2 дист. - остальное, рН 7,0-7,2. При температуре 42 С на полужидкой (0,1 агара) питательной среде в течение 14 суток, ультранизкий морозильник (-86 С) не менее года. Способ, условия и состав среды для размножения штамма. Состав среды (г/л) лактоза - 10, дрожжевой экстракт - 5, пептон - 10, мясо-пептонный бульон - 100, 2 НРО 43 Н 2 О - 2, 4 - 0,2, 442 - 0,05,- 0,5, аммония цитрат 3-х водн. - 3, цистеин гидрохлорид - 0,2, агар - 1, Н 2 Одист. - остальное,7,0-7,2. В течение 18-20 час. Оптимальные условия и состав среды для ферментации. Состав среды (г/л) лактоза - 10, дрожжевой экстракт - 5, пептон - 10, мясо-пептонный бульон - 100, К 2 НРО 43 Н 2 О - 2, 4 - 0,2, 442 - 0,05,- 0,5, аммония цитрат 3-х водн. - 3, цистеин гидрохлорид - 0,2, агар - 1, Н 2 Одист. - остальное, рН 7,0-7,2. Суть предлагаемого изобретения иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Влияние температуры культивирования на продукцию бактериоцинов штаммомБИМ В-456 Д. Значительное влияние на продукцию бактериоцинов оказывает температура культивирования бактерий. Согласно литературным данным температура, оптимальная для роста бактерий, не является оптимальной для синтеза бактериоцинов. При понижении или повышении температуры культивирования происходит уменьшение скорости роста бактерий и увеличение продукции бактериоцинов. С целью исследования влияния этого фактора на продукцию бактериоцинов бифидобактерии культивировали при 28 С, 37 С и 42 С. Установлено, что продукция бактериоцинов бифидобактериями в значительной мере определяется температурой культивирования. Оптимальной для роста бифидобактерий является температура 37 С, при которой продукция бактериоциновБИМ В-456 Д составляет 32,8 ед/мг. 3 13853 1 2010.12.30 При 28 С уБИМ В-456 Д наблюдается увеличение продукции бактериоцинов (по сравнению с культивированием при 37 С) на 45 ед/мг. При 42 С у заявляемого штамма наблюдается резкое снижение продукции бактериоцинов с 33 ед/мг до 12 ед/мг. Пример 2. Сравнительная характеристика биологической активности заявляемого штаммаБИМ В-456 Д и штамма-прототипаДВА-5. Заявляемый штаммБИМ В-456 Д обладает высокой биологической активностью и по некоторым параметрам превосходит выбранный в качестве прототипа штаммДВА-5 (таблица). Биологические свойства штаммовБИМ В-456 Д иДВА-5 при культивировании на различных питательных средах к 24 часам культивирования. Количество жизнеспособных клеток (1 КОЕ/мл) Активность кислотообразования(в градусах Тернера ) Уровеньв конце культивирования Антагонистическая активность по отношению к патогенной и условнопатогенной микрофлоре Наличие бактериоцинов Пример 3. Использование штаммаБИМ -456 Д для получения пробиотического препарата, содержащего живые клетки бифидобактерий. 1-я генерация. Проводят оживление лиофилизированной культурыБИМ В-456 Д. Для этого клетки вносят в питательную среду, выдерживают в течение получаса при комнатной температуре, затем переносят в термостат. Где выращивают при температуре 37-38 С в течение 18-20 часов и получают культуру 1-й генерации. 2-я генерация. Выращенный на предыдущем этапе посевной материал вносят из расчета 5 - 10 об.в стерильную посуду, и доливают предварительно проверенной на стерильность питательной средой, и культивируют при температуре 37-38 С в течение 18-20 час. 3-я генерация. Выращенный на предыдущем этапе посевной материал вносят из расчета 5-10 об.в ферментер и культивируют 20-24 часа при температуре 37-38 С. Титр бактерий при этом достигает 109 клеток в 1 мл. Активность бактериоцинов достигает 45-50 ед. В результате получают пробиотический препарат, полученный путем культивирования монокультуры бифидобактерий на жидких питательных средах, содержащий живые активные бактериальные клетки и бактериоцины. Пример 4. Использование штаммаБИМ -456 Д для получения закваски. 1-я генерация. Проводят оживление лиофилизированной культурыБИМ В-456 Д. Для этого клетки вносят в питательную среду, выдерживают в течение получаса при комнатной температуре, затем переносят в термостат, где выращивают при температуре 37-38 С в течение 18-20 часов и получают культуру 1-й генерации. 13853 1 2010.12.30 2-я генерация. Выращенный на предыдущем этапе посевной материал вносят из расчета 5-10 об.в стерильную посуду и доливают предварительно проверенной на стерильность питательной средой и культивируют при температуре 37-38 С в течение 18-20 час. 3-я генерация. Выращенный на предыдущем этапе посевной материал вносят из расчета 5-10 об.в емкость большего объема и культивируют 20-24 часа при температуре 37-38 С, получая культуру 3-й генерации. Титр бактерий при этом достигает 1010 клеток в 1 мл. Активность бактериоцинов - 45-50 ед. В результате получают закваску, которую вносят в стерильное обезжиренное молоко в количестве 10 от объема. Молоко с внесенной закваской культивируют в термостате при 37-38 С до образования сгустка, получая кисломолочный продукт с высоким содержанием (КОЕ 108-109) жизнеспособных клеток бифидобактерий. Таким образом, заявляемый штамм по важнейшим показателям - продукции бактериоцинов, биологической активности - превосходит известные аналоги и может использоваться для получения пробиотических препаратов или заквасок. Источники информации 1. Гончарова Г.И. и др. // Антибиотики и химиотерапия. - 1989. - Т. 34. -6. - С. 462-466. 2. ( ) //.. - 2000. - . 9. -2. - . 130-137. 3.. ( ) // . . . . - 2003. - . 92. -1. - . 69-78. 4.. ( ) // ., 1998. - . 61. -1. - . 47-51. 5.. ( ) // . . . - 2003. - . 95. -5. - . 1058-1069. 6. Патент 2317327 1, 2006 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5