Штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous – продуцент нитрилгидратазы

СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛ ИСТИЧЕСКИХ Р ЕСПУБЛ ИКГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССР(71) Саратовский филиал Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов и Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ННОВОСОССШЗ РНОВОСННОЦБ-ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ(57) Использование биотехнология. Сущность изобретения получение нового штам Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового штамма. обладающего высокой нитрилгидратазной активностью.Нитрипгидратаэа - фермент. катализирующий процесс гидролиза нитрилов карбоновых кислот в амиды.ма бактерии продуцента фермента нитрилгидратазы. выделенного из почвы ПРОИЗВОДСТва акрилонитрила. с использеванием в качестве селектирующего агента изобутиронитрила. Штамм Нлосососсоз глооослгоиз ВКПМ 5926 обладает следующими признаками грампоэитивный. неподвижный. спор не образует,некислотоустойчив. аэроб. Клетки в возрасте 18-20 ч образуют длинные слабоветвящиеся нити. которые через 48-72 ч ВЗСПЗДЗЮТСЯ на ПЗЛОЧКОВИДНЫЭ И КОККОВИДные элементы. Штамм Кпооососсие гпооослгоиэ 926 обладает высокой активностью ММОЛЬ Мг/мин в отношении изобутиронит рила. 220 ммоль/мг/мин в отношении ацетонитрила. 150 ммоль/мг/мин в отношении акрилонитрила. Штамм Нлооососсие глооосбгооз ВКПМЗ-Юб может быть использован в биотехнологическом процессе получения акриламида и других амидов карбоновых кислот. З табл.Одним из примеров использования этоГО ФЕРМЕНТЗ является ПОЛУЧЕНИЕ ЭКРИЛЭМИ да из акрилонитрила.Недостатком ДЭННЫХ ШТЭММОВ ЯВЛЯЕТся низкая ферментативная активность нитрилгидратазы, В случае штамма Согупебасгегшт М 774 удельная активность нитрилгьчдратазы не превышала 38.5 ед.Известен штамм Рвеиоотопав спгогогарпа 823. который при выращивании на среде. содержащей аминокислоту Ьцистеин (2 г/л). проявлял ферментативную активность 105.7 ед.Недостатком данного штамма является использование в кул ьтуральной среде дорогостоящей аминокислоты.Наиболее близким к изобретению по технической сущности является штамм Ат-З 24. мутант Рзеиоотопаз сыогогаргапв 523. который обладаетудельной нитрипгидратазной активностью 141 ед.Недостатками данногоштамма являются использование в среде культивирования дорогостоящих аминокислот Ь-пропина и Ьцистеигнагдрооное введение индуктора метакриламида.Целью изобретения является получение штамма с более высокой нитрилгидратазной активностью, не требующего использования аминокислот при выращивании. культивирование на простой синтетической среде.заявляемый штамм Нлооососсиз гроооспгоов МВ депонирован под номером 3-226 и характеризуется следующими морфолого-культуральньлми и физиолого-биохиьтическими признаками.Морфологические признаки штамм грамположительный. неподвижный, спор и капсул не образует, Некислотоустойчив. азроб, Клетки в возрасте 18-20 ч образуют длинные по 20 мкм. слабо ветвящиеся нити,которые через 4842 ч распадаются на паЛОЧКОЕИДНЫЕ И КОККОВИДНЫС ЭЛЕМВНТЫ.Палочковидные клетки имеют размеры О.912 х 20-200 мкм. Деление клеток происходит как по раскалывающемуся. так и по сгибающемуся типу. В протоплазма клеток видны внутриклеточные включения в виде зерен гранулярность протоппазмьл).Купьтуральные свойства при росте на гиясопептонном агаре штамм образует круглые гладкие колонии диаметром 1 мм 48-72 ч), поверхность сухая, матовая, розового цвета. При росте на мясопептонном бульоне образует пленку И осадок. Лакмусовое молоко не изменяет.Физиологические свойства штамм редуцирует нитраты. Тест с метиловым красныму реакция Фогес-Проскауэра отрицательные. Образует сероводород. Штамм оксида за отрицательный. каталаза- и фосфатазапопожительньтй. Растет при рН 6-9. оптимальное значение рН 7,0, при температуре 545 С. оптимальное значение температуры 3 ОС. В качестве источников азота использует соединения аммония и нитраты.Штамм дает кислую реакцию при росте на глюкозе, фруктозе, сорбите. манните и глицерина. Газообразование ни на одном сахаре не обнаружено. В качестве единственного источника углерода использует инозит. Маннит, мальтозу, сорбит. глюкозу. глицерин. лактат. пируват, не использует рамнозу. галактозу. Крахмал и целлюлозу не гидропизует, твин 60 и твин 80 гидролизует. Аденин не утилизирует.Химический состав клеток в клеточной стенке . содержится тезо-диаминопимелиновая кислота. арабиноза и галактоза. Содержится липид А (ЬСМ). характерный для родококков.Чувствительность к антибактериальным препаратам штамм чувствителен к канамицину, хлорамфениколу. ампициллину, пенициллину. мономициину, тетрациклину. рифампицину.ФВРМВНТЭТИБНУЮ ЭКТИВНОСТЬ ОПРЕДЕЛЯли с использованием в качестве субстратов нитрипов карбоновых кислот. За единицу удельной нитрилгидратазной активности принимали количество фермента. катализирующего образование 1 мкмоль амида в одну минуту, содержащегося в 1 мг сухого веса клеток.Штамм Нлооососсиз глооосйгоое МЗ, ВКПМ 5-926 обладает более высокой активностью нитрилгидратазы (150 ед.) по сравнению со штаммом прототипом Ат 324141 ед.) и не требует использования в культуральной среде дорогостоящих аминокислот.П р и м е р 1. Выделение штамма Нлооососсыз глоооспгоцз МВ. ВКПМ 5-925.Заявляемый штамм был выделен из почвы с производства акрилонитрила. Навеску почвы 1.0 г ресуспендировали в 10 мл физиологического раствора и отстаивали в течение 1 ч. Надосадочную жидкость в количестве 2 мл вносили в среду следующего50 мл суспензии инкубировали в 300 мл колбе Эрленмейера при 28-30 С при круговом перемешивании (число качаний 180-200 мин). Через двое суток отбирали 1 мл культуральной жидкости. серийно разводили в физиологическом растворе и высе 5 1731814 6вали на чашки Петри с агаризованной средой (1.5 агар-загара) вышеуказанного состава. Посевы инкубировали 48-72 ч при 2 ВЗ 0 С после чего отбирали наиболее крупные колонии. которые использовали а дальнейших исследованиях. Колонии пересевали на чашки Петри с мясопептонным агаром. Выделенные культуры изучали на способность к трансформации акрилонитрила в акриламид.Микроорганизмы выращивали в течение ДВУХ СУТОК на СРЕДЕ ВЫДЕЛЕНИЯ,отбирали 5 мл клеточной суспензии, центрифугировали, клетки отмывали 0.01 М фосфатным буфером. рН 7,6. ресуспендировали В 2 МЛ бу.ф.еватотожесоставгъсодержаще ГО акрилонитрил в концентрации 1 г/л. Реакцию останавливали добавлением 0.1 мл 1 н. НС 1. Количественное определение акриламида ОСУЩВСТВЛЯЛИ МЕТОДОМ ГЗЗОЖИДКОСТ ной хроматографии на хроматографа ЛХМ-ЗО с пламенно-ионизационным детектором. В качестве неподвижной фазы использовали Неор 1 ех 400.В результате была выделена культура Нлооососсце гпооослгоив М 8 с высокой нитрилгидратазной активностью.П р И м е р 2. Использование штамма Нлооососсиз глоооспгоиз М 8. ВКПМ 5-926 для трансформации изобутиронитрила в изобутирамид.Полученный штамм Нпооососсиз гпооослгоиз МВ. ВКПМ 5-926 предкультивироаали в колбах Эрденмейера, заполненных на 1/10 часть бульоном Хоттингера в ТВЧВНИЭ СУТОК, на качалке (ЧИСЛО КЭЧЗНИЙ 120 мин) при 30 С Купьтуральную жидкость в объеме 10 мл инокулировали в 1,5 л ферментер, Состав среды. гФерментацию вели при контролируемом значении рН. Подтитровку осуществляли 1 н. НС и 1 н. КОН.Из реакционной среды периодически отбирали пробы для определения концентрации клеток и их нитрил гидратазной активности. Концентрацию клеток определяли фотокалориметрически при длине волны 540 нм. толщине слоя 5.07 мм.Активность нитрилгидратазьл оценивали следующим образом.1 мл культуральной жидкости центрифугировали. клетки отмывали 0.01 М фосфа.тным буфером. рН 7.6. Буферную емкость и значение рН подбирали экспериментально,Клетки ресуспендировали вбуфере указанного состава до значения оптической плотности О.2-0.5 (А 540 нм). К 2 мл клеточной взвеси в фосфатном буфередобавляли изобутиронитрил в количестве 25 мкл. Реакцию проводили при 20 С втечение 10 мин. а затем останавливали добавлением 01 мл 1 н. НСЗ. Бактериальные клетки отделяли центрифугированием. Концентрацию изобутирамида в надосадочной жидкости анализировали методом газожидкостной хроматографии.Удельная активность нитрипгидратазь в отношении изобутиронитрила достигала 140 ед.П р и м е р 3 Использование штамма Нлооососсоз гпоооспгоцв МВ. ВКПМ 5-926 для трансформации ацетонитрила в ацетаМИД.Штамм Нлооососсиз гпооослгоиэ М 8 ВКПМ 5-926 подготавливали к процессу трансформации по примеру 2. Активность нитрилгидратазьл ОЦЕНИВЕЛИ ЭНЭЛОГИЧНО примеру 2. В качестве субстрата добавляли ацетонитрил в количестве 25 мкл.П р и м е р 4. Использование штамма Рпооососсиз глоооспгоиз М 8. ВКПМ 5-926 для трансформации акрилонитрила в акриПЗМИД.Штамм Нпооососсцв гпооослгооз МЗ,ВКПМ 5-926 подготавливали к процессу трансформации как в примере 2. Активность нитрилгидратазьп оценивали аналогично примеру 2. В качестве субстрата добавляли акрилонитрил в количестве 25 мкл.Изменение ферментативной активности в зависимости от стадии роста клеток представлена в табл. 1.АКТИВНОСТЬ НИТрИЛГИДрЗТЗЗЬЪ В ОТНОШЭ нии акрилонитрила достигала 150 ед.П р и м е р 5. Влияние температуры на активность н-итрилгидратазы штамма Нпооососсцз гпооослгоцв МВ, ВКПМ 5-926.Бактерии Нлооососсиэ глооослгоцв МВ. ВКПМ 3-926 выращивали в течение 70 ч И подготавливали к трансформации по приме 7ру 2. Образцы с реакционной смесью, содержащие 25 мкл акрилонитрила и 0.04 мг клеток по сухому весу в 2 мл 0.025 М фосфатного буфера. рН 7,6. инкубировали в течение 5 мин при различных температурах. Концентрацию образовавшегося в реакциОННОЙ СМЕСИ акриламида ОППВДЕЛЯЛИ С ПО мощью газожидкостной хроматографии. Изменение активности нитрилгидратазы в зависимости от температуры проведения реакции трансформации представлено в табл. 2.Таким образом нитрилгидратаза из штамма Ппооососсив гпооослкоив М 8. ВКПМ 5-926 обладает более высокой термостабильностью, чем вналогичный- фермент из Рзеиоотопав сыогогарпйе В 23 (температурный оптимум 20 С) и Нпобососспв ар. М 774 (температурный оптимум 35 С)П р и м е р 6. Индукция нитрилгидратазы при росте штамма Кпооососсиз глоооспгооз МВ, БКПМ 5-926 на мочевина.Штамм Нлооососсиз гпооослгоиз МВ. В КПМ 5-926 предкультивировали в колбах Эрленмейера. содержащих бульон Хоттингера в течение суток на качалке при 30 С. 10 мл культуральной жидкости инокулировали в колбы Эрленмейера. содержащие 200 мл синтетической среды с различным КОЛИЧЕСТВОМ МОЧБВИНЫ. СОСТЭВ СИНТЕТИЧЕКлетки растили в течение 72 ч при 30 С. Активность нитрилгидратазы определяли по примеру 2. Изменение активности нитрилгидратазы в зависимости от концентрации мочевины в среде представлено в табл. 3.Результаты табл. 3 показывают. что уровень индукции нитрилгидратазы возрастает с ростом концентрации мочевины в среде и УДЕПЬНЭЯ ЭКТИВНОСТЬ ДОСТИГЭЕТ МЭКСИМЗЛЬного значения при концентрации мочевины 16 г/л.Заявляемый бактериальный штамм МЗ. ВКПМ 5-926 на основании таксономического изучения отнесен к виду Нлооососсиз гпоооспгооз. Штамм обладает индуцибельной нитрилгидратазой. осуществляющей гидролиз алифатических нитрилов в амиды. Индукция нитрилгидратазы достигается при выращивании клеток Клооососсиз гпоооспгоиз МВ на минеральной среде систочника азота и индуктора нитрилы и амиды органических кислот. например изобутиронитрил или изобутирамид. а в качестве источника углерода глюкозу. Максимальная активность нитрилгидратазы (Удельная активность 300 и общая активность 2400) наблюдается при использовании в качестве источника азота и индуктора мочевины ко МВРЧЕСКИ ДОСТУПНОГО СОЕДИНЕНИЯ. ЧТО ОСО ОЕННО ВЭЖНО В СЛуЧЭЕ ПрОМЫШЛЭННОГОИСПОПЬЗОВЗНИЯ ШТЭММЭ. ЕЩЕ ОДНИМ ВЗЖНЫМ ТВХНОЛОГИЧВСКИМ преимуществом ИСПОЛЬЗОвания штамма Нлооососсоз гроооспгооз М 8 в качестве катализатора при гидролизе нитрилов является высокая термостабильность нитрилгидратазы. Максимальная активность фермента (1000 ед.) наблюдается при 53 С.Штамм Нпооососсиз глооослгоив МВ,ВКПМ 5-926 может быть рекомендован как продуцент фермента нитрилгидратазьв и использован в биотехнологическом процессе получения акриламида и других амидов карбоновых кислот.Штамм бактерий Нпооососсов гпоооспгоов БКПМ 5-926 продуцент нитрилгидратазы.Удельная нитрил гидратазная а1 УКЭЗЭННЫЕ ВЕЛИЧИНЫ ОПТИЧЕСКОЙ ПЛОТНОСТИ ППОМВРЯПИ ПОСЛЕ СООТВЕТСТВУЮЩИХ