Способ получения штаммов бактерий Escherichia coli и Pseudomonas putida – продуцентов креатинамидиногидролазы

СОЮЗ СОВЕТСНИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ РЕСПУБЛИН. при гннт ссор Умдрддыинь ФОН 1 з ,ОПИСАНИЕ и ОБРЕТЕНИЯ м Ь 4 Г 1 дГГЕР 11 ГЪ/ А. 1 12(46) 15.11.89. Бюл.Ю 42 бактерий ЕвсЬег 1 сЬ 1 а со 11 н РвепаоС 7) БЗРИНГЗР МЗННХЗЙМ Гмбх (РЕ) шопаз рп 1 оа. Цель изобретения(72)-Гюнтер Шумахер, Петер БУКЕЛЬ дуцирующнн креатинамидиогидролазу.Выделяют ДНК из Рвецдошопаз рцсйда,урасщепляютэндонуклеаэой ЕСОКТ, фрагмент размером 5,8 кВ обрабатыают эндонуклеазами ЕсоЕ 1 и РЧЦ 11 и полу чают фрагмент размером 2,2 кв, который клоннруют в расщепленный эндонуклеазой вектор, трансформируют в штамм Е.со 11 ВЕН 2102 И Р.рп 1 ба(56) АгсЬ 1 уевоЕ Вйоспеш апа В 1 орпу 5,из п 4420562, кл. с 12 Ы 9/78, . 1983.11521) сносов получвнин штлмов вактвгин вэснввхсньх соц и гввпвомоынзразрушения клеток, наматмщания ДК на стеклянную палочку после двух обч работок фенолом н осаждения этанолом,растворяют ее в концентрации 1600 Мг/мл 10 мг хромосомной ДНК обрабатывают 5 единицами ЕсоВ 1 и анализируют степень переваривания в агарозном геле, 10 бактери штамма Е.со 11 ЕВ ВЗИ 2102 ннкубируют вприсутствин 511081 фагов Шарон 10 в течение 20 мин при 37 С И затем оставляют для гроста доначала лизирования бактерий В 500 мл полной среды с последующим выделением фага 10 рг Щарон 10 ДНК полностью раст щепляют 1 мг.ЕсоВ 1-зндонуклеаэы разрезанную хромосомную ДК Р 5 еиоВыделяют ДНК из Рвеиаошопаа рц 1 па, расщепляют эндонуклеазой ЕсоК 1 с выделением фрагмента размером 5,8 кВ, обрабатывают его ЭНд 0 НУКЛеа зам ЕсоВ 1 и Руи 11 и получают фрагмент размером 2,2 кВ, которы клонируют в расщепленный вектор, трансформируют в соответствующи Е.со 11 и Р.рис 1 аа.П р и м е р. Выделяют хромосомную ДК Рвецаошопав рпсйда В 5 М 2106 послешопаа рцс 1 аа ннкубируют с 3 г рас щепленного эндонуклеаэой ЕсоЕ 1 ДНКфага Шаров 10 с до единицами фермен та Тд ДНК-лигазы. Упаковку связанныхпротеины фага Ф производят в пробир ке. Около 0,5 рдг связанных Щ н Рвен ошопав ДНК ннкубируют посредствомисходной смеси нарез Б 0 мин добавляют 0,5 мл БЫ буферного раствора, 1/200 объемаинкуируют при помощи 200 л выдержан ного в течение ночи штамма Е.со 11На 1 юг введенной ДНК получают около рт фаговьш отверстий (тромбоцитов). 5 Для идентифицирования фагов кото рые содержат кодируютий КРеаТИНаУрИз пяти положительных в иМУН 9 тесте с ферментом тромбоцитов лолу- Ь чают препарат фегов-ДК.РасЩеппение 1 пяти различных ДК посредством-0 ЕсоВ 1 позволило выявить ДНК-полосу во всех пяти фагах ДНК-5,8 кВ.Приблизительно 5 г этого ЕсоВ 1 фрагмента расщепляют принсполъзова ни Руи 11 эндонуклеазы н выделяют Щлрагмент размером 2 дкв.0 бразуюшиесн фрагменты ДНК разделяют в нивкоплавком геле агарозы по их размеру ивыделяют фрагмент ЕсоВ 1 - Руц 11.Выделение ДНК-фрагментов из низко плавких гелей агарозы производят выреванием соответствующих полос, переводом в пробирку (трУ 50 ЧКУЭппендорфа) и смешиванием приблизи тельно с двухкратным объемом воды,затем инкубнруют при 65 С до ТЕК 7 5 опор (от 5 до 10 мин), пока Не Рас плавится агароза, пробу встряхивают в течение короткого времени и потом интенсивно встряхивают с половиной объема фенола (нейтрализованногоЕ) Фазы разделяют центрифугировакием за НО-мин при 5000 А 5 и верхнююводную фазу снова экстрагируют встряверкнюю фазу дважды экстрагируют путем встряхивания с простым эфиром(ло 1 мл), простой эфир выпаривают при 6550 и ДНК осаждают при помощи 1/10 объема 3 М ацетата натрия с рН.72 и 2,5-кратного объема этанола при 20 С. ДНК осаждают центрифугированием за 10 мин при 15000 3, сушат в вакууме и вводят в 10 Мл ТЕВсе описанные дальше выделения фрагментов произво-. ДЯТ ЗНЗЛОГИЧНО ц у .Около 4 шгрВК.322 ДК расщепляют посредством ЕсоВ 1 и Руп 11 и выделяют фрагмент размером.2,3 кВ. 0,2 -рг этого рВВ 322-фрагмента инкубируют в течение ночи в присутствии пяти единиц Тд ДНК-лигазы и 0,5 рт ЕсоЕ 1 Руи 11 фрагмента размером 2,2 кв из описанных-Й -фагов. Полученную платч миду называют рВТ-3-2, она кодируетв Е.со 11 биологически активную креатинаэу. . Пжр н м е р 2. Фрагмент ДНК, коДИРУШЩИ креатиназуизпщазмиды рВТч 3 2, обрабатывают нитрозогуанидином.ВыделяютплазмиднуюДКпосле-лизирования клеток при помощи метода СЗС 1- этнлбромд.-Клетки штамма Есо 11 ЕВ 8 б 54 трансформруют при помощи плавммдной ДНК и помещаютна пластинах полной среды(ъв)д содержащик 20 ерг/мл амлнцнллина. После инкубации в течение ночи при 37 С на ЪВпластины помещают нитроцеллюлозную фнлътровальнУЮ 5 Умагу. После инкубалии в течение 12-18 ч при 37 С иитроцеллюлозный фильтр с кодную учашку титан-тсм), гв которую был добавлен 1-мл омесихлороформа сза 20 мин при 379 С.Затем нитроцелт ллоэнй фильтр накладывают на индикаторную агаровную пластину таким обрач зом чтобы возникал лрнной контактмежду клеткам и индикаторной пластие ной. . ЦВЕФНЗ Реакцияпроискодштваависимости от времени н количества сннтезий рованной в отдельных клона креатиназы. Из описанной системы фильтрования выделяют клон Ед с.плавммдои рВТ 2 а-1,ВЗМ 3143.-Эта-плазмда кодирует креатиназу, которая составляет около 502 растворенного протеина клеток. Как альтернатиук описанному прямому НС-мутагеневу увеличение уровниэкспрессивности креатнназы можно достнгнуть с помощью 1 ас-промотора (последни можно вьшелять из имеющихсяв продаже плазмид например РПСЬ плазмид),у Для этого ппазмиду рБт-3-2 обрабатывают ЕсоЕ 1 эндонук. леааой обрабатывают эндонуклеаэойоколо 10100 вр скаждой СТОРОНЫ 10Затем 1 аспромотор при помощи ФгРМеН та Тд-питаем, связывающего концы,вводят в укороченную плазмиду ВТ 32. Эту ДНК мутагенизируют с нитрозогуанивином, после этого применяют для трансформации штамма ЕВ И клены нс пытывают на высокую экспрссивность гена.для отбора актиности, принцип которой состоит в том, что креатин расщепляют ферментами креатинамидиногндволатч зы исарказиноксилазы наобразовання НО 5 через пероксидазу в 1/2 02 иНд 0 и осуществляет реакцию кислорода с системой цветного индикатора, например, из 4-аминоантипирнна (ДААН) И Ы-этилН-(сульфоэтип)-3-метиланилина,соли ЕЗТ. Образуется голубовато-фиолет товое окрашивание, которое при избыткедаэы представляет степень синтезиротванной в колонияхкреатинамидиногидЭо лазы.Состав системы фильтрующей активности креатинамиднногндрилазы показанУказанные в пунктах 1 г 7 реактивы растворяют и смешивают с одинаковым объемом низкоплавкой агарозы (22), б мл выливают в чашку Петрнд пластины можно хранить около 2 недель при дС 3П р И м е р З. для клонирования и обеспечения экспрессивности клонированной креатинамдиногидролааы в доРзепошопав рцс 1 аа применяют плазми ду ЕБ 1010. НЕЕ 1 О 0 Лннеаризнруют посредством 9511 и из плазмиды рАСУС 177 после НАЕЖ 1 - расщепления вьщеляютпри использовании Тдтпигазы, получают щаяся плазмида представляет собой рВТ 306,1 ЕЗ 1016 н производные этой плазмиды отличаются широким диапаэоном 5 о хозяина и пригодны, например, для Рвецаошопаеп и Е.со 11. Плазмду рВТ 2 а 1 расщепляют посредством Рчи 1 нрВТ 306,1 плазмду расщепляют посредт 55 ством Руц 1 и 8 ша 1 и выделяют фрагмент размером 10 кВ. 0,5 г векторнойИ идентифицируют кодирующие креатиназу клопы при помощи отбора активности напластинах. Из одного из положитепьныхклонов получают нометоду с С 8 С 1 этилтбромидом плаэмидную ДНК. плазмида имеет название рВТ 306,16 ВЗМ 3149 Р,Трансформируют-плазмндную ДНК в Раеидошопаэ рис 1 а 2440. При помощи фильтрования с отборомактивности на пластинах идентифицируютполонительные кланы. Это возможно у Рзеобошопаз рцсйаа 2440, хотя этот штамм содержит кромосомшокодированную креатннамидиногидролазу, так как экст прессивность кодированной плазмдноЕ креатинамидиногидролаэы проявляется структурно. Этот отлнчительны признак. позволяет проводить различие между кодированной кромосомой И копирован ной плазммдной креатинамщдиногидрола вой.П р И м е р 4. Определение активчности креатинамидиногидролазы производят обнаружениемобразованнЫх вйрд эультате реакций с уреазой ионов аммония с тестткомбинацией мочевинаЧДикий тип Рвецаошопаз рц 1 а 2 д 4 О для определения активности креатинамидиногидролазы инкубируют при 3 ОС в течение ночи в Втсреде (5 мл),которая содержит Ъ креатина..1) и без отбора на содержание плази промывают один раз в 50 ММ фосфатного буферного раствора с рН 7,5.Клетки в первоначальном объеме вводят в фосфатны буферный раствор (50 ММ с рН 7,5) и растворяют обработкой ультразвуком (д 30 с).креатинамиднногидролазу, проводят Описанным способом, с тем исключением,что Среда. не Содержит Креатина для индукции и что отбирают с добавкой ампицнллина (20 рт/мл для плазмиды рВТ 2 а-1) или стрептомицина (20 мкг/ми для плаэммды рвт 306.16). Рост культур происходит для Рвецдошопав рЦЕ 1 да при 3 ОС, для Е.со 11 при 37 С.Данные показывают, что в реэультаЬ 2 о те клонирования креатинамидиногидро лавы в Есо 11 бактерии получают новоеногидролазу-и эта зкспрессивность- в противоположность исходному штамму 25 Рвеибошопав риЕ 1 а проявляется струк-. турно как для Е.со 11, так и для Рвецошопав рцсйба. Благодаря мутагенеау ДНК, кодирующих креатииамидиногидролазу, можно достигнуть особенновысо-30 кой экспрессивиости. Гактивность составляет 500 ед./г биомассы (влажной), удельная активность 45-еда/мг протеина. так как удельная 3активность высокоочищенного протеина 35составляет 9 ед./мг, это означает,что креатинамидиногидролаза в Е.со 11 составляет 502 растворимого протеина Анализ сырого экстракта в ВББ-геле показывает, что креатинамидиногидролаза представляет основную полосу фрак- дин растворимого протеина..систем хозяина Е.со 11 а именно в.со 11 И 3350, в.со 11 ЕД 8654 и Е.со 11 СН 1. пцаэмиду рвт 2 а-1 трансформируют в соответствующие компетентныеклетки Отдельные колонии культуры выращивают в ВТТ-среде, которая содержит 20 мг/мл ампициллина в течение ночи при 37 Сы Ферментационную среду.(ВТ) засеваютпредварительной культурой (инокулятды оставляют на 20-30 ч при З 7 С дляроста Активность креатинамИдИН 0 Гидр 0 лазы после 25 ч инкубироваиия составляет около 600 ед/г сырой массы или д,5 ед./мг протеина.Плазмиду рВТ 306.16 трансформируют в клетки Рзеооошопаз росйда штаммаПосле очистки Отдельных колоний инкубируют культуру в ВУТ-среде,которая содержит 200 рг/мл стрептомицина при 30 С в-течение ночи. Ферментационную среду (ДУТ) засевают(инокулят 12) и оставляют культуру для роста на 20-30 ч при 30 С. Активность после 25 ч составляет около 220 ед./г сырой массы, активность 18 едмг протеина. .Способ получения штатов бактерий ЕвсЬе 1 сЬ 1 а со 11 и Рвецбошопав рцс 1 да ПРОДУЦЕНТОВ КРЕЗТИНЗМИДИОГИДРО лазы, заключающийся в том, что хромосомную ДНК из Рзецбошопав рцсьба ПБМ 2106 и ДНК фага Шарон 10 обраба- тывают эндонуклеазой ЕсоВ 1, лигируют полученные фрагменты, упаковывают гибридные ДК в присутствии 2-х протеинов оболочки фата, трасдуцируют полученными гибридными фагами клетки Есо 11 П 5 М 2102, которые предварителъно обрабатывают в течение ночи 0,2-ныл раствором мальтозы и растворяют в 0,1 М/л М 5 В 0-далее идентифи цируют фаги, экспрессирующие креатина МНДИНОГИДРОЛЕ-ЗУ С ПОМОЩЬЮ ЪПЖДИКЗТОР ной системы, содержаюей 6-мг/Мл тетрад метилбенэидина 20 мг/мл диоктилнатрийсукцинатаи 0,012 Нд 01 в 62-ной желатина, выделяют фаги, дающие положительную реакцию, ДНК атихфагов об-1 рабатывают эндоиуклеазойЕсо.Е 1 с последующим выделением фрагмента размером 5,8 кВ, которые обрабатывают эндонуклеавой Руи 11, выделяютЕсо.К 1 Руи 11 фрагмент размером 2,2 кВ,которыилигируют с расщеплнным Г Есо-31 и Руп 11 вектором рвк 322, получениой рекомбинантиой ДНК трансфор мируют клетки бактерий Е.со 11 ВЗМ 7 2102, отбирают клетки, конститутивно продуцирующиекреатиназу полученныегуанидином, выделяют плаэмидную ДНК,которой трансформируют клеткиЕ.со 11 ПЗМ 2102, отбирают бактерий, содержащие плазиду рВТ 2 а-1, попучен ной плазмидной ДНК трансформируют Е.со 11 П 5 М 2102 и обрабатывают ее