Способ получения бактериального концентрата пропионово-кислых бактерий

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО КОНЦЕНТРАТА ПРОПИОНОВО-КИСЛЫХ БАКТЕРИЙ(71) Заявитель Научно-производственное республиканское дочернее унитарное предприятие Институт мясомолочной промышленности Республиканского унитарного предпрятия Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по продовольствию(72) Авторы Богданова Людмила Леонидовна Фурик Наталья Николаевна Сафроненко Людмила Владимировна Дудко Наталья Владимировна(73) Патентообладатель Научно-производственное республиканское дочернее унитарное предприятие Институт мясомолочной промышленности Республиканского унитарного предпрятия Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по продовольствию(56)2309982 2, 2007.1145978 , 1985.9599 1, 2007.366739, 1973.3159490, 1964.507296, 1976.1711788 1, 1992.1469613 1, 1993.5026647, 1991.2392312 2, 2010.3298 1, 2007.10855 1, 2008. БОГДАНОВА Л.Л. и др. Актуальные вопросы переработки мясного и молочного сырья Сб. научн. трудов 2009. - Минск, 2010. - С. 48-61.(57) Способ получения бактериального концентрата пропионово-кислых бактерий, включающий приготовление питательной среды, внесение инокулята, наращивание биомассы бактериальных клеток, ее отделение от культуральной среды, смешивание с защитной средой, замораживание и сублимационное высушивание, отличающийся тем, что используют питательную среду, содержащую 3,0-3,5 мас.по сухому веществу гидролизованного обезжиренного молока, 10,0-12,0 мас.солодового экстракта, разбавленного водой в соотношении 15, 0,5 мас.дрожжевого экстракта, 2,0 мас.лактозы, 0,1 мас.агара,0,2 мас.натрия уксуснокислого, 0,5 мас.натрия лимоннокислого, 0,3 мас.аммония сернокислого, 0,012 мас.магния сернокислого, 0,02 мас.марганца сернокислого,0,1 мас.калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,2 мас.калия фосфорнокислого двузамещенного, 0,015 мас.цистина, 0,0012 мас.хлористого кобальта и воду дистиллированную - остальное, в которую вносят инокулят штамма.2388 -, или штамма.2017 -, или штамма.2018 - в количестве 7-10 . 17328 1 2013.08.30 Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано для выработки сыра и кисломолочных продуктов функционального профиля, обогащенных пропионово-кислыми бактериями. Для производства кисломолочных продуктов функционального профиля используются закваски или бактериальные концентраты, содержащие в основном бифидобактерии и лактобациллы, которые являются основными представителями нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) человека. Известны патенты по получению моноконцентратов бифидобактерий 01686718,01817285,02222954,02058063, лактобацилл 02067994,02120762. Функциональные свойства проявляют и пропионово-кислые бактерии, которые в процессе жизнедеятельности стимулируют иммунные механизмы защиты организма и выделяют соединения с антиоксидантной активностью, обладающие выраженным антимутагенным действием. В результате их жизнедеятельности образуется витамин В 12 , а также накапливаются пропионовая кислота и органические вещества, которые обуславливают вкусовой букет продукта. По данным исследователей бактерии. формируют типичный сладковатый вкус ферментируемого продукта вследствие образования свободного пролина, который получается в результате протеолиза казеина при воздействии фермента пролиламинопептидазы. Известно, что большинство штаммов пропионово-кислых бактерий обладает слабой кислотообразующей активностью и практически не ферментирует молоко. Поэтому эти бактерии вводят в состав многих бактериальных концентратов наряду с кислотообразующими микроорганизмами патенты 202082921385512185436,20031258582260978 и др Приготовление таких поливидовых бактериальных концентратов не всегда позволяет сохранить необходимое соотношение микроорганизмов при совместном выращивании культур с различными скоростью и температурным оптимумом роста. Анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявленного изобретения, позволили установить, что источник, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения, не обнаружен. По способу получения моноконцетрата пропионово-кислых бактерий известен патент Российской федерации 2309982 2, 2007. Способ обеспечивает повышение биохимической активности пропионово-кислых бактерий(штамм МГУ) и создание на его основе бактериального концентрата, ферментирующего молоко. Недостатками данного способа являются необходимая активизация штамма пропионово-кислых бактерий -галактозидазой, что усложняет технологию производства бактериального концентрата, стоимость препарата (ее значительно увеличивает высокая цена фермента -галактозидазы), а также то, что по способу получают бактериальный концентрат только одного вида пропионово-кислых бактерий, тогда как на опыте сыроделия Гудков А.В. Сыроделие технологические, биологические и физико-химические аспекты,2003 показано, что при приготовлении сыра наиболее эффективно применение штаммов нескольких видов или подвидов пропионово-кислых бактерий. Близким по техническому решению является известный патент 1521769, МПК 23 9/12, 1989, на получение питательной среды для накопления биомассы пропионовокислых бактерий разных видов, используемой при получении бактериального концентрата. Целью патента является удешевление питательной среды, в качестве которой используется культуральная жидкость после выращивания молочнокислых бактерий с добавкой кукурузного экстракта и солей сернокислого аммония и хлористого кобальта. Однако недостатками данного способа являются технологическая сложность приготовления среды (освобождение культуральной жидкости от лактобактерий требует мембранной очистки или центрифугирования) и медленный рост на подобранной среде пропионово-кислых бактерий (в течение 72 ч), что может привести к инфицированию культур. 2 17328 1 2013.08.30 Задачей данного изобретения является получение моновидовых бактериальных концентратов разных видов пропионово-кислых бактерий с высоким содержанием жизнеспособных клеток (не менее 51010 КОЕ/г) при сокращении продолжительности процесса наращивания бактериальной биомассы, предназначенной для внесения в молоко, сливки или нормализованную молочную смесь при изготовлении ферментированных молочных продуктов функционального назначения и сыров. Поставленная задача достигается тем, что для производства бактериальных концентратов разных подвидов пропионово-кислых бактерий разработан состав питательной среды, позволяющий при внесении 7-10 инокулята.(штамм 2388 МНО-) или(штамм 2017 МНО- или 2018 МНО-) сократить срок наращивания биомассы до 182 ч. Штаммы используемых пропионово-кислых бактерий выделены авторами изобретения из естественных или производственных источников или селекционированы без применения генных модификаций и под указанными номерами депонированы в Централизованной отраслевой коллекции промышленных штаммов молочнокислых бактерий РУП Институт мясо-молочной промышленности (разрешение на депонирование Национального центра интеллектуальной собственности РБ 21-17/52-44, 2008). Селекцию штаммов проводили путем их многократного посева на питательную среду,содержащую в качестве источника углерода и энергии молочную кислоту, -лактат кальция и 2 агара, при дальнейшем отборе наиболее крупных моноколоний после 5-7 суток роста культур при температуре 322 С. Морфология штаммов. Форму колоний и размер клеток штаммов определяли при выращивании на разных питательных средах (, ГМС, тиогликолевая среда). На поверхности агаризованных сред культуры образовывали округлые блестящие колонии, в толще агаризованных сред - дисковидные колонии коричневатого (штаммы 2017 МНО-, 2018 МНО-) или желтовато-коричневого (2388 МНО-) цвета. Физиолого-биохимические свойства штаммов. Штамм 2017 МНО- (депонирован в Централизованной отраслевой коллекции промышленных штаммов молочнокислых бактерий РУП Институт мясо-молочной промышленности под номером ДМ-1) - факультативный анаэроб. Клетки имеют форму кокковидных палочек, неподвижные, грамположительные. Метаболизм бродильного типа штамм сбраживает глюкозу с образованием пропионовой, уксусной кислот и 2, лактозу, маннозу,фруктозу, галактозу, глицерин. Не ферментирует раффинозу, мальтозу, -арабинозу, мелицитозу, сахарозу, трегалозу, салицин. Диацетил, ацетоин, индол не образует. Желатин не разжижает, нитрат не восстанавливает, аргинин не гидролизует, каталазоположительный. Устойчив к 4, 20 желчи. Слабый кислотообразователь (время образования молочного сгустка при внесении 3-5 инокулята - 168 ч), предельная кислотность в молоке достигает 92 Т, образует молочный сгусток неплотной консистенции. Обладает способностью к росту в диапазоне температур 10-40 С. Штамм 2018 МНО- (депонирован в Централизованной отраслевой коллекции промышленных штаммов молочнокислых бактерий РУП Институт мясо-молочной промышленности под номером ДМ-2) - факультативный анаэроб. Клетки имеют форму кокковидных палочек, неподвижные, грамположительные. Метаболизм бродильного типа штамм сбраживает глюкозу с образованием пропионовой, уксусной кислот и 2, лактозу, маннозу,галактозу, глицерин. Не ферментирует раффинозу, мальтозу, -арабинозу, мелицитозу,сахарозу, трегалозу, фруктозу, салицин. Диацетил, ацетоин, индол не образует. Желатин не разжижает, нитрат не восстанавливает, аргинин не гидролизует, каталазоположительный. Устойчив к 4, 20 желчи. Слабый кислотообразователь (время образования молочного сгустка при внесении 3-5 инокулята - 152 ч), предельная кислотность в молоке достигает 100 Т, образует молочный сгусток неплотной консистенции. Обладает способностью к росту в диапазоне температур 10-40 С. 3 17328 1 2013.08.30 Штамм 2388 МНО- (депонирован в Централизованной отраслевой коллекции промышленных штаммов молочнокислых бактерий РУП Институт мясо-молочной промышленности под номером ДМ-3) - факультативный анаэроб. Клетки имеют форму полиморфных палочек, иногда кокковидных, неподвижные, грамположительные. Метаболизм бродильного типа штамм сбраживает глюкозу с образованием пропионовой, уксусной кислот и 2, лактозу, маннозу, галактозу, глицерин. Не ферментирует раффинозу, мальтозу, арабинозу, мелицитозу, сахарозу, трегалозу, фруктозу, салицин. Диацетил, ацетоин, индол не образует. Желатин не разжижает, нитрат не восстанавливает, аргинин не гидролизует,каталазоположительный. Устойчив к 2, 10 желчи. Слабый кислотообразователь(время образования молочного сгустка при внесении 3-5 инокулята - 160 ч), предельная кислотность в молоке достигает 98 Т, образует молочный сгусток неплотной консистенции. Обладает способностью к росту в диапазоне температур 15-37 С. На основании морфологических особенностей и физиолого-биохимических свойств штамм 2388 МНО- определен как. ,штаммы 2017 МНО- и 2018 МНО- отнесены к подвиду. Определитель бактерий Берджи. 9-е изд. -М. Мир, 1997. Способ получения бактериального концентрата пропионово-кислых бактерий осуществляют следующим образом Питательную среду для получения посевного материала бактерий в лабораторных условиях стерилизуют при 1211 С в течение 15 мин, в условиях производства бактериального концентрата среду стерилизуют при 1161 С в течение 40 мин и охлаждают до 322 С - температуры роста бактериальных культур. Проводят культивирование микроорганизмов в течение 182 ч, затем бактериальную биомассу отделяют от культуральной жидкости центрифугированием, смешивают с защитной средой (11), разливают в стерильные кюветы сушилки, замораживают при температуре минус 402 С и высушивают сублимационным методом. При замораживании и высушивании биомассы бактерий используется защитная среда, содержащая следующие компонентысахароза - 10, лимоннокислый натрий - 5, дистиллированная вода - до 100. Защитную среду стерилизуют при температуре 1211 С в течение 10 мин, охлаждают и хранят до использования. Пример 1. Для накопления биомассы пропионово-кислых бактерий готовят питательную среду,содержащую 880 см 3 гидролизованного протосубтилином 4,5 -ного обезжиренного молока, в которое вносят 100 см 3 разбавленного водой (15) солодового экстракта 5 г дрожжевого экстракта 2 г натрия уксуснокислого 5 г натрия лимоннокислого 3 г аммония сернокислого 0,12 г магния сернокислого 0,2 г марганца сернокислого 1 г калия фосфорнокислого однозамещенного 2 г калия фосфорнокислого двухзамещенного 0,15 г цистина (цистеина) 0,012 г кобальта хлористого 1 г агара. Активную кислотность среды 7,10,1 ед.устанавливают с помощью 30-40 -ного раствора . Среду стерилизуют при температуре 1211 С в течение 15 мин. Непосредственно перед внесением посевного материала в питательную среду вносят в условиях асептики стерильный 40 -ный раствор глюкозы (из расчета 20 г сухого вещества на 1000 см 3 среды). Готовую среду охлаждают до 302 С, вносят инокулят пропионово-кислых бактерий.2388 МНО- в количестве 9 и культивируют в течение 182 ч при 302 С до изменения величины оптической плотности культуральной среды на 0,6-0,8 ед. ОП (при длине волны 540 нм). Значение активной кислотности среды поддерживают в интервале 5,8-6,3 ед.путем автоматической нейтрализации 30 -ным раствором гидроокиси натрия. Культивирование пропионово-кислых бактерий проводят при перемешивании при скорости мешалки 50-100 об/мин. После окончания процесса культивирования среду охлаждают до температуры 102 С. Биомассу отделяют от культуральной среды методом центрифугирования на промышленной 4 17328 1 2013.08.30 бактофуге со скоростью вращения ротора 15000-17000 об/мин. Затем биомассу смешивают с заранее приготовленной стерильной защитной средой в соотношении 11. Суспензию клеток с защитной средой разливают в стерильные кюветы сушилки, замораживают при температуре минус 402 С в течение трех ч. Сублимационное высушивание проводят при температуре в начале сушки минус 402 С, досушивают при температуре 302 С до достижения в готовом продукте массовой доли влаги не более 5 . Полученный концентрат пропионово-кислых бактерий с титром 51010-51011 КОЕ/г представляет однородную порошкообразную массу кремового или светло-коричневого цвета. Пример 2. Согласно примеру 1, с той лишь разницей, что вместо 880 см 3 обезжиренного молока,гидролизованного протосубтилином, используют 880 см 3 обезжиренного молока, гидролизованного алкалазой, и вносят 9 инокулята пропионово-кислых бактерий.2388 МНО-. Пример 3. Для накопления биомассы пропионово-кислых бактерий готовят питательную среду,содержащую 300 см 3 гидролизованного панкреатином 10 -ного обезжиренного молока(из расчета 30 г сухого вещества на 1000 см 3 среды), в которую вносят 120 см 3 разбавленного водой (15) солодового экстракта 5 г дрожжевого экстракта 2 г натрия уксуснокислого 5 г натрия лимоннокислого 3 г аммония сернокислого 0,12 г магния сернокислого 0,2 г марганца сернокислого 1 г калия фосфорнокислого однозамещенного 2 г калия фосфорнокислого двухзамещенного 0,15 г цистина (цистеина) 0,012 г кобальта хлористого 1 г агара дистиллированная вода до 1 л. Активную кислотность среды 7,10,1 ед. устанавливают с помощью 30-40 -ного раствора . Среду стерилизуют при температуре 1211 С в течение 15 мин. Непосредственно перед употреблением в расплавленную питательную среду вносят в условиях асептики стерильный 40 -ный раствор лактозы (из расчета 20 г сухого вещества на 1000 см 3 среды). Готовую среду охлаждают до 322 С, вносят инокулят штаммов пропионово-кислых бактерий,.2017 МНО- в количестве 7 и культивируют в течение 182 ч при 322 С до изменения величины оптической плотности культуральной среды на 0,6-0,8 ед. ОП (при длине волны 540 нм). Значение активной кислотности среды поддерживают в интервале 5,8-6,3 ед.путем автоматической нейтрализации 30 -ным раствором гидроокиси натрия. Культивирование пропионово-кислых бактерий проводят при перемешивании при скорости мешалки 50100 об/мин. После окончания процесса культивирования среду охлаждают до температуры 102 С. Биомассу отделяют от культуральной среды на промышленной центрифуге со скоростью вращения ротора 15000-17000 об/мин. Затем биомассу смешивают с заранее приготовленной стерильной защитной средой в соотношении 11. Суспензию клеток с защитной средой разливают в стерильные кюветы сушилки, замораживают при температуре минус 402 С в течение 3 ч. Сублимационное высушивание проводят при температуре в начале сушки минус 402 С, досушивают при температуре 302 С до достижения в готовом продукте массовой доли влаги не более 5 . Полученный концентрат пропионово-кислых бактерий с титром 51010-51011 КОЕ/г представляет однородную порошкообразную массу кремового или светло-коричневого цвета. Пример 4. Согласно примеру 2, с той лишь разницей, что используют 880 см 3 обезжиренного молока, гидролизованного протосубтилином 10 , инокулята штамма пропионово-кислых бактерий.2018 МНО-. Полученный концентрат бактерий с титром 1010-1012 КОЕ/г представляет однородную порошкообразную массу кремового или светло-коричневого цвета. 17328 1 2013.08.30 Использование изобретения позволяет получить моновидовые концентраты пропионово-кислых бактерий прямого внесения с высоким содержанием (51010-51011 КОЕ/г) жизнеспособных клеток в течение 182 ч. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6