Способ получения бактериального препарата на основе бифидобактерий

23 9/12 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ БИФИДОБАКТЕРИЙ(71) Заявитель Бобова Ольга Евгеньевна(72) Автор Бобов Анатолий Анатольевич(73) Патентообладатель Бобова Ольга Евгеньевна(57) 1. Способ получения бактериального препарата на основе бифидобактерий, включающий приготовление питательной среды, охлаждение до температуры культивирования,внесение чистых культур бифидобактерий, культивирование с последующим выделением биомассы из культуральной жидкости, отличающийся тем, что в питательную среду в процессе ее приготовления вносят селенит натрия и сернокислый магний в массовом соотношении (1-1,25)1. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве чистых культур бифидобактерий вносят, по крайней мере, одну культуру или несколько культур, взятых в равных количествах, включающих,ии/или, и/или, при этом в среду вносят 1,0-1,5 об.каждой культуры.(56)1686718 1, 1996.2087532 1, 1997.2005119 1, 1993.863639, 1981.192986 1, 1986.2120762 1, 1998.2060673 1, 1996. Изобретение относится к биотехнологии, медицинской микробиологии, ветеринарии и может быть использовано для обогащения биологически активным селеном продуктов питания и придания им лечебно-профилактического значения, способствующего поддержанию статуса синантропных бифидобактерий взрослых людей, нормализации кишечной микрофлоры новорожденных и больных дисбактериозом кишечника вследствие лучевой болезни, последствий химиотерапии и антибиотикотерапии. Известен способ приготовления бактериального препарата на основе живых бифидобактерий и лактобактерий путем одновременного внесения в стерильное молоко закваски бифидобактерий и лактобактерий, перемешивания и культивирования (пат. РФ 2060673,публ. 1996 г.). 6008 1 Из известных способов получения бактериальных препаратов наиболее близким является способ получения бактериального концентрата для производства кисломолочных продуктов, включающий приготовление питательной среды на основе творожной сыворотки с добавлением лактозы и хлористого магния, обработку среды дрожжевой галактозидазой, культивирование бифидобактерийс последующим выделением биомассы, ее смешивание с защитной средой и хранение перед использованием в замороженном виде (А.с. СССР 1686718, А 23 С 9/12, публ. 1996). Известные способы обеспечивают рост бифидобактерий, которые обладают определенной активностью и жизнеспособностью для сокращения продолжительности сквашивания молока. Однако лечебно-профилактическое действие известных бактериальных концентратов имеют ограниченную область использования как по возрасту людей, употребляющих эти продукты, так и по спектру антибиотикоустойчивости и антагонистической активности. Задача, на решение которой направлено изобретение, состояла в том, чтобы создать условия для получения бактериального препарата, при которых он содержит клеточносвязанный селен в биологически активной форме, и расширить диапазон полезно используемых бифидобактерий, присущих организму человека в зависимости от возраста. Согласно изобретению, поставленная задача решена следующим образом. Предложен способ получения бактериального препарата на основе бифидобактерий,включающий приготовление питательной среды, охлаждение до температуры культивирования, внесение чистых культур бифидобактерий, культивирование с последующим выделением биомассы из культуральной жидкости, в котором, согласно изобретению, в питательную среду в процессе ее приготовления вносят селенит натрия и сернокислый магний в соотношении от 1 до 1,25 к 1 в качестве чистых культур вносят, по крайней мере, одну культуру или несколько культур, взятых в равных количествах, включающих,ии/или, и/или, при этом в среду вносят от 1,0 до 1,5 об.каждой культуры. Предложенный способ осуществляют следующим образом. Готовят питательную среду следующего состава (г/л) пептон - 10 лактоза - 10 цитрат натрия - 6 дигидрофосфат калия - 1 гидрофосфат натрия - 2 гидрохлорид цистеина - 0,15 (или аскорбиновая кислота - 0,5) агар - 0,5 раствор кукурузного экстракта (16) - 50 мл. В среду культивирования вносят сернокислый магний в количестве 0,012 г/л и селенит натрия в количестве от 0,012 до 0,015 г/л. Объем питательной среды доводят до 1000 мл дистиллированной водой. Исходный рН среды 7,0-7,2. Питательную среду стерилизуют при температуре 115-120 С, охлаждают до температуры культивирования 37-39 С и вносят 1,0-1,5 об.чистых культур,и/или, и/или,и/или, взятых, соответственно, в соотношении 11111, и культивируют до достижения титра бактерий не менее 109. Подобное соотношение вносимых в состав питательной среды селена и серы позволяет достичь максимального накопления внутриклеточного селена в биологически активной органической форме, преимущественно в форме аминокислот. Созданный бактериальный препарат обладает повышенной антагонистической активностью к представителям патогенной микрофлоры, а также высокой антибиотикоустойчивостью, что позволяет поддерживать статус кишечной микрофлоры при проведении антибиотикотерапии. Данные, представленные в табл. 1, показывают видовой состав синантропных бифидобактерий, в основном присущий организму человека в зависимисти от возраста. Из табл. 1 следует, что грудные дети имеют четыре вида бифидобактерий, дети до 3-х лет имеют пять видов бифидобактерий, а люди старше 3-х лет - три вида бифидобактерий. Данные, представленные в табл. 2, показывают чувствительность бифидобактерий, составляющих ассоциацию, к антибиотикам. Из табл. 2 следует, что бифидобактерий, включенные в ассоциацию, обеспечивают взаимное перекрытие спектров их антибиотикоустойчивости. 2 6008 1 Данные, представленные в табл. 3, показывают антагонистическую активность бифидобактерий. Из табл. 3 следует, что наличие в клетках бифидобактерий селена увеличивает антагонистическую активность как чистых культур, так и ассоциаций бифидобактерий особенно в отношении .и . . Данные, представленные в табл. 4, показывают срок жизненной активности и кислотообразующую активность ассоциации бифидобактерий, содержащих внутриклеточный селен. Из табл. 4 следует, что селен оказывает активизирующее влияние на некоторые свойства бифидобактерий, увеличивая их жизнеспособность на 20 и кислотообразующую активность на 18 . Данные, представленные в табл. 5, показывают влияние селена на продолжительность фаз роста и количества клеток в ассоциаци бифидобактерий. Из табл. 5 следует, что внесение селена в среду роста бифидобактерий значительно сокращает экспоненциальную фазу роста бактерий и удлиняет стационарную фазу. При этом на порядок увеличивается накопление биомассы бифидобактериями (см. К.О.Е. - колонииобразующие единицы). Пример 1. В состав для приготовления питательной среды вносят по 0,012 г/л сернокислого магния и селенита натрия. Объем раствора доводят до 1000 мл дистиллированной водой. Питательную среду стерилизуют при 115-120 С в течение 20 минут, охлаждают до температуры культивирования, вносят в нее 1,0-1,5 об.чистой культурыи культивируют в течение 48-72 часов при температуре 37 С до достижения титра бактерий не менее 109. Антагонистическая активность бифидобактерий (поз. 2 табл. 3) при наличии в клетках селена увеличивается на 5-23 , особенно в отношении культурантагонистов .и . . Примеры 2-5. Среду для культивирования бифидобактерий готовят способом, аналогичным примеру 1. В качестве чистых культур в среду вносят 1,0-1,5 об.либо, либо, либо. Антагонистическая активность бифидобактерий при наличии в клетках селена увеличивается на 15-20 особенно в отношении .и .(поз. 4 табл. 3) на 11-20 особенно в отношении .(поз. 6 табл. 3) на 13-25 особенно в отношении .(поз.8 табл. 3) на 7-36 особенно в отношении Е,(поз. 10 табл. 3). Примеры 6-8. В состав питательной среды вносят селенит натрия в концентрации, обеспечивающей оптимальные конкурентные отношения с серой по потреблению из среды культивирования,преимущественно 0,012-0,015 г/л и 0,012 г/л соответственно. В стерилизованную и охлажденную до температуры культивирования среду вносят в отдельные емкости чистые культуры. В качестве чистых культур используют,,,,. При этом в производственную добавку вводят с учетом их синантропности в зависимости от возраста людей и антибиотикоустойчивости три, четыре или пять штаммов в соотношении 111 1111 11111, соответственно. Антагонистическая активность ассоциации бифидобактерий (поз. 12, 14, 16 табл. 3) возрастает в два-три раза при наличии внутриклеточного селена в биологически активной форме. Для получения обогащенных селеном и бифидобактериями жидких продуктов питания (молоко, кефир, сливки и др.) в исходный продукт питания вносится ассоциация бифидобактерий с учетом их синантропности в зависимости от возраста людей и антибиотикоустойчивости и в количестве, обеспечивающем титр в готовом продукте питания 107-8. Пример 9. Цельное коровье молоко нормализуют по массовой доле жира, подогревают и очищают, гомогенизируют при давлении 12,52,5 МПа и температуре от 45 до 79 С, пастеризуют при температуре 922 С 3-5 мин, охлаждают и направляют в промежуточный резервуар. В охлажденное молоко вносят ассоциацию 5 (или 4, или 3), клетки которой содержат связанный селен, перемешивают в те 3 6008 1 чение 3-5 мин до получения однородной консистенции, разливают и охлаждают в камере до температуры не более 42 С. Пример 10. В цельное молоко вносят стимулятор роста ГМК-3 в количестве 0,20 г/л. Смесь тщательно перемешивают, очищают, подогревают до температуры 422 С, очищают на центробежных молокоочистителях и гомогенизируют при давлении 152,5 МПа и температуре от 45 до 85 С, смесь пастеризуют при температуре 952 С с выдержкой от 30 до 40 минут или стерилизуют в ферментерах при давлении 0,05 МПа, охлаждают до температуры заквашивания (392 С) и заквашивают ассоциацией бифидобактерий, содержащих внутриклеточный биологически активный селен. Заквашенную смесь перемешивают в течение 102 мин и оставляют в покое. Сквашивание проводят при температуре 371 С от 3 до 6 часов до образования молочного сгустка кислотностью 604 Т. По окончании сквашивания охлаждают продукт до температуры 4-6 С и разливают. Пример 11. В обезжиренное молоко вносят стимулятор роста - кукурузный экстракт в количестве 0,0027 л/л. Смесь тщательно перемешивают, очищают, подогревают до температуры 422 С, очищают на центробежных молокоочистителях и гомогенизируют при давлении 152,5 МПа и температуре от 45 до 85 С. Смесь пастеризуют при температуре 952 С с выдержкой от 30 до 40 минут или стерилизуют в ферментерах при давлении 0,05 МПа,охлаждают до температуры заквашивания 392 С и заквашивают ассоциацией бифидобактерий, содержащих внутриклеточный биологически активный селен. Заквашенную смесь перемешивают в течение 102 минут и оставляют в покое. Сквашивание проводят при температуре 371 С от 3 до 6 часов до образования молочного сгустка кислотностью 604 Т. По окончании сквашивания охлаждают продукт до температуры 4-6 С и разливают. Поскольку заявитель ведет обширные исследования возможностей полезного использования ассоциации бифидобактерий, содержащих внутриклеточный биологически активный селен, его притязания не исчерпываются приведенными выше примерами. Таблица 1 Возраст Грудные дети Дети до 3-х лет Люди старше 3-х Антибиотик Канамицин Гентамицин Мономицин Стрептомицин Левомицитин Тетрациклин Оксацилин Неомицин Цефалотин Линкомицин Полимиксин 6008 1 Таблица 3 Культуры антагонисты Культуры бифидобак п/п Таблица 5 Лаг-фаза час К.О.Е Культивирование без селена Культивирование с селеном Фазы роста Экспоненциальная час К.О.Е Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.