Штамм гриба Paecilomyces marquandii БИМ F-351Д, используемый для получения (2′-5′)-олигоаденилатов

(71) Заявители Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Кухарская Татьяна Александровна Ерошевская Людмила Анатольевна Зинченко Анатолий Иванович Кулак Тамара Ивановна Калиниченко Елена Николаевна(73) Патентообладатели Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(2-5)-олигоаденилатов. Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и представляет собой новый штаммБИМ -351 Д, который способен специфически гидролизовать (3-5)-межнуклеотидные связи олиго- и полирибонуклеотидов и может быть использован для получения (2-5)-олигоаденилатов общей формулы А(2 р 5 А), где 2-3(2-5)-олигоаденилаты представляют собой олигонуклеотиды, состоящие из нескольких аденозиновых фрагментов, связанных между собой (2-5)-фосфодиэфирной связью. Эти соединения обладают активностью против вирусов животных 1 и растений 2-4,а также антипролиферативным 5, цитокининоподобным 6,7 и фиторострегуляторным 8,9 действием. Наибольшую биологическую активность проявляют тример А(2 р 5 А)2 и тетрамер А(2 р 5 А)3. Известен химико-ферментативный способ получения (2-5)-олигоаденилатов 10, предусматривающий полимеризацию три-н-октиловой соли аденозин-2(3)-монофосфата в диоксане в присутствии дифенилхлорфосфата, приводящей к полимеру, содержащему как(2-5)-, так и (3-5)-межнуклеотидные связи, с последующей обработкой его двумя высокоочищенными ферментами - рибонуклеазой, гидролизующей только (3-5)-межнуклеотидные связи, и щелочной фосфатазой, отщепляющей концевые фосфатные остатки. Процедура выделения целевых продуктов из реакционной смеси включает гельфильтрацию через колонку с сефадексом Г-25 и ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. Выход целевых продуктов составляет А(2 р 5 А)2 - 7,5 и А(2 р 5 А)3 - 2,6 . Недостатками известного способа являются а) длительность ферментативных стадий процесса, составляющая 36 ч (18 ч при гидролизе смешанного (2-5)/(3-5)-полиаденилата рибонуклеазой и 18 ч - при обработке фосфатазой) б) трудоемкость, обусловленная необходимостью выделения и очистки двух микробных ферментов. Способы, предусматривающие использование для получения (2-5)-олигоаденилатов в качестве источника (3-5)-специфической рибонуклеазы и фосфатазы фильтратов культуральных жидкостей (ФКЖ) микроорганизмов, и соответствующие штаммы микроорганизмов не известны. Целью изобретения является получение нового штамма мицелиального гриба-351 Д, ФКЖ которого содержит комплекс ферментов (рибонуклеазу и фосфатазу), способный гидролизовать только (3-5)-межнуклеотидные связи, в связи с чем его можно использовать для получения (2-5)-олигоаденилатов из полиаденилатов, содержащих одновременно (2-5)- и (3-5)-межнуклеотидные связи. Штамм-351 Д получен из штаммаБИМ -329 (Белорусская коллекция непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси) путем многократного рассева на чашки Петри с модифицированной агаризованной средой Чапека, содержащей 0,2 поли-А в качестве единственного источника фосфора, с последующим отбором наиболее активных вариантов методом реплик на агаризованные минеральные среды с 0,2 поли-А или (2-5)-олигоаденилата в качестве единственных источников фосфора. Штамм-351 Д характеризуется следующими свойствами. Морфологические признаки. На среде Чапека с 2 сахарозы (4-5 суток роста при 26 С) вегетативный мицелий разветвленный, густой. Под микроскопом конидиеносцы имеют вид ответвлений от воздушного мицелия. Прямостоящие, до 100 мкм длиной, мутовчато-разветвленные. Конидии эллипсоидные, гладкие, бесцветные (3,0-3,5) х (2,0-2,5) мкм, собраны в длинные цепочки. Колонии выпуклые, белые, с обильным пушистым воздушным мицелием, ровными краями. Диаметр колоний 10-12 мм, обратная сторона кремовая. На седьмые сутки роста колонии достигают в диаметре 17-18 мм. Воздушный мицелий приобретает в центре лиловый цвет. На картофельно-декстрозном агаре пятисуточные колонии имеют диаметр 8-10 мм,выпуклые, густо опушенные, воздушный мицелий сиреневого цвета, обратная сторона колоний желтая. На седьмые-восьмые сутки колонии становятся ярко-сиреневыми. 2 10732 1 2008.06.30 Культура сохраняет жизнеспособность не менее года при хранении в холодильнике (46 С) на агаре Чапека или картофеле-декстрозном агаре под слоем вазелинового масла, а также в лиофильно высушенном (криопротектор -10 -ное обезжиренное молоко) состоянии при 4-6 С. Культуральные признаки и физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Оптимальная температура роста 24-26 С. В глубинной культуре растет в диапазоне исходных значений 4,0-9,0 с оптимумом 6,5-7,5. Штамм для роста на предлагаемых средах стимуляторов не требует. Сбраживает до кислоты глюкозу, арабинозу, ксилозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, лактозу. Активно усваивает глицерин, маннит, дульцит, сорбит. Штамм хорошо разжижает желатин, молоко пептонизирует. Интенсивно гидролизует крахмал. Усваивает аммонийный и нитратный азот. Наиболее активный рост биомассы обеспечивают органические источники азота (пептон, дрожжевой экстракт, ферментализат кормовых дрожжей). Штамм не токсичен и не патогенен для теплокровных животных. Содержание ГЦ в составе ДНК 51,70,5 мол.(определено оптическим методом). ФКЖБИМ -351 Д обладает способностью гидролизовать поли-А до аденозина. Способность гидролизовать (2-5)-олигоаденилаты практически не проявляется. Активность ферментативного комплекса измеряют путем прямого определения количества аденозина, освобождающегося из полимерного состояния при инкубации ФКЖ со смешанным (2-5)/(3-5)-полиаденилатом. С этой целью реакционную смесь (1 мл), содержащую 5 мг (2-5)/(3-5)-полиа-А, 0,12 мл ФКЖ и 0,05 М натрий-ацетатный буфер ( 6,0), инкубируют при 60 С в течение 15 мин. Затем реакционную смесь подвергают тонкослойной хроматографии на пластинах -254 (, Германия) в системе растворителей изо-пропиловый спирт - 25 -ный водный раствор аммиака - вода (712). Исходный и конечный продукт реакции обнаруживают в УФ-свете, идентифицируя их сравнением с положением образцов-свидетелей, и элюируют 0,05 М натрий-фосфатным буфером ( 7,0). Светопоглощение элюатов замеряют на спектрофотометре. Концентрацию образовавшегося в ходе реакции аденозина рассчитывают, используя коэффициент молярной экстинкции при 260 нм, равный 15400. За единицу активности ферментативного комплекса принимают такое его количество,которое обеспечивает образование в течение 1 мин в описанных условиях 1 нмоля аденозина. Эффективность штаммаБИМ -351 Д в сравнении с другими штаммами микроорганизмов представлена в таблице. Сравнительная оценка эффективности наиболее активных (из 90 проверенных) штаммов микроорганизмов Штаммы микроорганизмовБИМ -351 ДБИМ -329 ЦМПМ -308 ЦМПМ -2927 ВКПМ -342 БИ -102 ЦМПМ -2752 БИМ В-245 БИМ -218 10732 1 2008.06.30 Из данных таблицы следует, что эффективность штаммаБИМ-351 Д значительно превышает любой из проверенных штаммов микроорганизмов. Предлагаемый штамм получен впервые и никогда ранее для получения (2-5)-олигоаденилатов не использовался. Использование штаммаБИМ -351 Д иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения. Пример 1 Культуру штаммаБИМ -351 Д, выращенную при 25 С в течение 14 суток на скошенной в пробирках агаризованной среде Чапека, высевают в колбу Эрленмейера объемом 2,0 л, содержащую 0,8 л среды следующего состава (г/л) КН 2 РО 4 (безводный) - 0,15- 0,25 472 - 0,0125 Глюкоза - 50,0 Пептон - 5,0 472-0,0125 3 - 5,0 Молочная кислота - 4,0.среды - 4,5 (доводится с помощью 25 -го водного раствора аммиака). Режим автоклавирования - 113 С 30 мин. Выращивание проводят на биологических качалках с частотой колебания платформы 170-190 об/мин при температуре 25 С в течение пяти суток. После окончания культивирования культуральную жидкость фильтруют, получая ФКЖ, активность которого в реакции гидролиза смешанного (2-5)/(3-5)-полиаденилата составляет 2340,0 ед./мл. Пример 2 Посевным материалом (100 мл), приготовленным аналогично примеру 1, засевают лабораторный ферментер АК-3, содержащий 2 л питательной среды того же состава. Ферментацию ведут трое суток при 25 С с аэрацией 0,4 л/мин на 1 л среды. После окончания культивирования гриба культуральную жидкость фильтруют, получая ФКЖ, активность которого в реакции гидролиза смешанного (2-5)/(3-5)-полиаденилата составляет 2326,7 ед./мл. Пример 3 Полученную по примеру 2 ФКЖ в количестве 6 мл прибавляют к 44 мл 0,06 М натрий-ацетатного буфера ( 6,0), содержащего 0,25 г смешанного (2-5)/(3-5)полиаденилата, который предварительно получают путем реакции полимеризации аденозин-2(3)-монофосфата под действием дифенилдихлорфосфата 10. Смесь инкубируют при перемешивании в течение 1 ч при 60 С. Затем реакционную смесь наносят на колонку (120 см 3) с ДЕАЕ-целлолозой в НСО 3 форме. Элюцию (2-5)-олигоаденилатов проводят водным раствором триэтиламмонийбикарбоната в градиенте концентрации 0,0010,3 М общий объем элюента 1,6 л. Фракции, содержащие УФ-поглощающий материал, упаривают, получая при этом 18,7 мг (7,5 ) А(2 р 5 А)2 и 8,3 мг (3,3 ) А(2 р 5 А)3. Структура целевых продуктов подтверждена сравнением их хроматографических подвижностей , а также параметров УФ- и ПМР-спектров с соответствующими характеристиками заведомо известных образцов. Характеристики полученного А(2 р 5 А)2 УФ-спектр, макс ( 7,0), нм ( ) 259 (4,55). ПМР-спектр в 2,(м. д. от ТМС) 8,18 с 8,10 с 8,00 с 7,96 с 7,92 с и 7,76 с (по 1 Н,Н-2, Н-8) 6,08 д (1, Н-1, 1,24,5 Гц) 5,92 д (1, Н-1, 1,23,0 Гц) 5,86 д (1 Н, Н-1,1,25,2 Гц). Характеристики полученного А(2 р 5 А)3 УФ-спектр, макс ( 7,0), нм ( ) 259 (4,65). 4 10732 1 2008.06.30 ПМР-спектр в 2,(м. д. от ТМС) 8,13 с (1 Н), 8,07 с (1 Н), 7,91 с (2 Н), 7,88 с (2 Н),7,82 с (1 Н) и 7,77 с (1) (Н-2, Н-8) 6,05 д (1 Н, Н-1, 1,24,8 Гц) 5,90 д (1 Н, Н-1,1,24,2 Гц) 5,84 д (1 Н, Н-1, 1,21,8 Гц) 5,80 д (1, Н-1, 1,24,2 Гц). Таким образом, заявляемый штамм грибаБИМ -351 Д может быть использован для получения (2-5)-олигоаденилатов. Использование предлагаемого штамма для получения (2-5)-олигоаденилатов обеспечивает по сравнению с известным химико-ферментативным способом следующие преимущества а) сокращение длительности ферментативной стадии процесса с 36 ч до 1 ч б) снижение трудоемкости процесса за счет устранения необходимости выделения и очистки двух микробных ферментов. Источники информации 1..,.,.(2-5) // .-1982.- . 216,4553.-. 1415-1416. 2..,.,. 5- 2,5, ,// . . .1984.- . 259,6.- . 34823486. 3. Канавалава Г Выкарыстанне нгбтарау в пры аздарауленн бульбы метадам культуры тканк // Весц АН Беларус. Сер. бял. навук. - 1990. -6.- С. 70-72. 4..,О.,. Изучение антивирусного и антиклеточного действия синтетического (2-5)-олигоаденилата (А 2 р 5 А 2 р 5 А) на мышах с лейкемией Раушера //.- 1983. - . 27,6.- . 47783. 5. Тальянский М.Э., Малышенко СИ., Каплан И.Б. и др. Индукция цитокониновой активности у растений, обработанных интерфероном человека и 2-5 олигоаденилатами // Докл. АН СССР. - 1987. - Т. 293,1.-С. 253-256. 6. Литвяк В.В. Влияние 2-5-олигоаденилатов на обмен кетосахаров прорастающей пшеницы // Весц АН Беларусь Сер. бял. навук. - 2001,4. - С. 108-111. 7..,.,.(25)//. - 1979. - . 282,5741. - . 849-851. 8. СССР 1790886. МКИ 5 А 01 43/08. Стимулятор роста картофеля / Т.И. Боткина, А.И. Быховец, С.Л. Быховец и др. 9. Быховец С.Л., Квасюк Е.И., Михайлопуло И.А. и др. Влияние 2,5-олигоаденилатов на продуктивность и биохимический состав клубней картофеля // Доклады АН Беларуси.1995. - Т. 39,6. - С. 79-82. 10. Карпейский М.Я., Мамаева , Михайлов С.Н. и др. Применение нуклеаз для синтеза 2-5-олигоаденилатов и их аналогов // Биоорганическая химия.- 1983.- Т. 9,4.С. 496-504. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5