Штамм Bacillus alvei КМИЭВ-11, используемый для получения вирусспецифических белков вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

61 39/265 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ШТАММКМИЭВ-11, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУССПЕЦИФИЧЕСКИХ БЕЛКОВ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(71) Заявитель Красочко Петр Альбинович(72) Авторы Красочко Петр Альбинович Фукс Полина ПавловнаВолосянко Елена ВикторовнаКрасочко Ирина Александровна(73) Патентообладатель Красочко Петр Альбинович(57) ШтаммКМИЭВ-11, используемый для получения вирусспецифических белков вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.(56)2059415 1, 1996.96009259 , 1998.98/47374 1.05252964 , 1993. Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и вирусологии, в частности к биотехнологии, и может быть использовано для получения вирусспецифических белков для конструирования диагностических и профилактических препаратов при вирусных инфекциях крупного рогатого скота. Известен микроорганизм . -724, являющийся возбудителем европейского гнильца пчел 1. Однако в антигенной структуре его не содержится вирусспецифических белков и участков ДНК, комплементарных вирусам животных. Известны штаммы вируса инфекционного ринотрахеита, являющиеся источником вирусспецифических белков, которые получают путем культивирования вирусов на культуре клеток 2. Недостатком этого является сложная технология накопления вирусной массы, необходимость в культуре клеток, небольшой выход вирусспецифического белка - до 1-3 , что значительно удорожает стоимость вакцинных и диагностических препаратов. Задачей изобретения является выявления штамма бактерий, имеющего участки дезоксирибонуклеиновой кислоты, комплементарной вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и белки, антигенно-родственные вирусу инфекционного ринотрахеита. 6091 1 Поставленная задача достигается тем, что источником специфических белков вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота является штамм бактерий . КМИЭВ-11, имеющий участки дезоксирибонуклеиновой кислоты, комплементарной вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и белки, антигенно-родственные этому вирусу. Пример 1. Штамм . КМИЭВ-11 выделен из пораженных европейским гнильцом личинок пчел, задепонирован и хранится в Коллекции Микроорганизмов института экспериментальной ветеринарии и ему присвоен номер КМИЭВ-11. Хранение микроорганизма осуществляется при 24 после лиофильного высушивания в полужидком мясопептонном агаре в течение 1-1,5 лет. Жизнеспособность его поддерживается путем пересева на мясо-пептонный агар 1 раз в течение 2-3 месяцев при условии хранения при 24. Согласно классификации микроорганизмов по Берги . КМИЭВ-11 относится ко второй морфологической группе спорообразующих аэробов, т.к. бактериальные клетки увеличивают объем при спорообразовании, споры эллипсовидные, расположены центрально или терминально. В указанной группе . КМИЭВ-11 принадлежит к подгруппе Б, в которую включены виды, не образующие газ при ферментации углеводов. Изучаемая бацилла представляет собой крупную палочку размером 2-5 х 0,5-0,8 мкм, она грамположительна, подвижна. На плотных питательных средах (МПА) при температуре 37 С в аэробных условиях образует колонии серо-белого цвета, мелкие, диаметром 1-3 мм, плоские, круглые, иногда неопределенной формы, с ровными краями, не врастающими в агар. При культивировании на мясо-пептонном бульоне (МПБ) заметно помутнение,иногда образуется пристеночное кольцо. В биохимическом отношении . КМИЭВ-11 слабо активен. Бактерии обладают каталазной активностью, дают положительную реакции. Фогес-Проскауэра, способствуют образованию кислоты при ферментации глюкозы, индола. Сероводород не выделяется. Не ферментирует арабинозу, манит, ксилозу, лактозу, сахарозу. Пример 2. Наличие антигенов, перекрестно-реагирующих с антигенами вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, определяли путем постановки реакции бласттрансформации лимфоцитов, сенсибилизированных взвесью бактерий . КМИЭВ-11 в системеи антивированных антигеном вируса инфекционного ринотрахеита в системе. Постановку реакции осуществляли пробирочным микрометодом с последующим морфологическим учетом. В качестве антигена использован преципитирующий антиген вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота,представляющий собой ранние белки вируса (производство Украинского НИИ экспериментальной и клинической ветеринарной медицины Украинской академии аграрных наук). Для оценки сенсибилизации организма антигенами вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота учет проводили путем подсчета 300 лимфоцитов и выведения процента бластов в каждой исследуемой пробе. Для оценки сенсибилизации лимфоцитов крупного рогатого скота было отобрано 15 телят возрастом 2-2,5 месяца и живой массой 60-65 кг, которых разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. Телятам подопытной группы 1 вводили внутримышечно 4 мл инактивированных формальдегидом бактериальной взвеси . КМИЭВ-11 при концентрации 10 млрд. микробных тел в мл телятам подопытной группы 2 внутримышечно по 2 мл живой культуральной вирус-вакцины против инфекционного ринотрахеита Монорин производства Покровского завода биопрепаратов (инфекционный титр вируса 5,5 ТЦД 50/мл) телятам третьей(контрольной) группы водили внутримышечно по 5 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. Через 10 дней после обработок у всех животных была взята кровь для исследования. Результаты исследований представлены в таблице. Из представленных в таблице данных видно, что у обработанных телят взвесью бактерий . КМИЭВ-11 отмечена сенсибилизация лимфоцитов антигенами вирусов ин 2 6091 1 фекционного ринотрахеита, подтвержденная увеличением количества бластов, возникших под воздействием митогена - антигена вируса инфекционного ринотрахеита. Пример 3. Для выявления комплементарных участков ДНК вируса инфекционного ринотрахеита и . КМИЭВ-11 изучали наличие их в плазмидах с помощью электрофоретического анализа. Комплементарность ДНК плазмиды . КМИЭВ-11 и ДНК вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота изучали методом точечной гибридизации с радиоактивной меткой (ДНК-зонд разработан и изготовлен в Московской ветеринарной академии). В ходе исследований, проведенных в 8-ми повторностях, получены положительные результаты гибридизации ДНК вируса инфекционного ринотрахеита и ДНК плазмиды, выделенной из . ИЭ-11. Источники информации 1. Каталог культур микроорганизмов института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН и Всероссийской коллекции микроорганизмов. - Пущино Москва, 1992. С. 33. 2. Крюков Н.Н., Белкина Н.М., Семенихин А.Л. Получение модифицированного вируса ИРТ крупного рогатого скота и испытание его иммуногенных свойств // Бюлл. ВИЭВ. 1972. - Вып.14. - С.5-8. Таблица Результаты изучения перекрестно-реагирующих антигенов у вирусов и бактерий в реакции бласттрансформации ( бластов)п/п Дни взятия крови До введения Через 10 дней 8,81,235,23,48,51,745,13,48,92,28,71,2 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.