Штамм бактериальной культуры LEUCONOSTOC MESENTEROIDES БМП-98 для производства декстрана

(12) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ШТАММ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫБМП-98 ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ДЕКСТРАНА(71) Заявитель Открытое акционерное общество Белмедпрепараты(72) Авторы Царенков Валерий Минович Гаврилов Михаил Владимирович Скрипко Анна Дмитриевна Петров Петр Тимофеевич Кузнецова Инна Ивановна Тюрин Виталий Иванович(73) Патентообладатель Открытое акционерное общество Белмедпрепараты(57) Штамм бактериальной культурыБМП-98 (КПМКБ В 18-1) для производства декстрана - субстанции плазмозамещающих препаратов.(56)0363633 1, 1990.227908, 1981.2039754 1, 1995.1559717 1, 1994. Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности, к производству плазмозамещающих препаратов на основе декстрана, и касается штамма продуцента декстрана. Известны бактериальные культуры,,синтезирующие декстран из сахарозы ( . -., 1972, 23. - . 389-397). Для промышленного биологического синтеза нативного декстрана в РБ с 1958 года использовался штаммСФ-4, выделенный из сахарного песка.(Сельцовская Г.С. Биологический синтез нативного декстрана - первый этап получения плазмозаменителя полиглюкина. - М., 1957. - С. 6 (прототип). Декстранобразующая способность (ДОС) штамма СФ-4 на солевой среде составляет 36,4 от количества сахара в питательной среде при средней продолжительности ферментации 70 ч. (Волоханович А.И. и др. Химико-фармацевтический журнал, 1975. - Т. 9. -3. - С. 42). Задачей изобретения является получение штамма, имеющего более высокую ДОС при укороченном цикле ферментации. Новый штамм (условное название - БМП-98) получен путем воздействия ультрафиолета (лампа БУВ-30, интенсивность светового потока 410-5 Вт) на микробную суспензию штамма СФ-4 с последующим многоступенчатым отбором вариантов по признакам ДОС и укороченного цикла ферментации. Микроорганизмы штамма представляют собой слегка удлиненные граммположительные неподвижные кокки, размножающиеся поперечным делением. Спор не образуют. На среде с сахарозой образуют капсулы, которые имеют полисахаридную структуру. 5793 1 Культурально-морфологические особенности штамма при выращивании на плотных средах представлены в примерах 1-4. Пример 1. Агаризованная среда состава 1. КС 1,0 г 2. КН 2 РО 4 2,0 г 3.24122 5,0 г 4. Пептон 1,0 г 5. Сахар-рафинад 100 г 6. Дрожжевой экстракт 0,02 г 7. Агар-агар 14 г 8. Вода дистиллированная до 1000 мл. рН среды 6,4 - 6,8, стерилизация 120 С в течение 20 мин. Штамм культивируют на чашках Петри в течение 48 ч при температуре 24 С. Колонии на агаризованной среде 5-6 мм в диаметре, блестящие, прозрачные, выпуклые, правильной круглой формы. Пример 2. Агаризованная среда состава 1. КС 1,0 г 2. КН 2 РО 4 2,0 г 3.24122 5,0 г 4. Пептон 1,0 г 5. Глюкоза 100 г 6. Дрожжевой экстракт 0,02 г 7. Агар-агар 14 г 8. Вода дистиллированная до 1000 мл. рН среды 6,4-6,8, стерилизация 120 С в течение 20 мин. Штамм культивируют на чашках Петри в течение 48 ч при температуре 24 С. Колонии на агаризованной среде 2-3 мм в диаметре, блестящие, прозрачные, выпуклые, правильной круглой формы. Пример 3. Агаризованная среда состава 1. Пептон 10,0 г 2.5,0 г 3. Агар-агар 20,0 г 4. Вода мясная до 1000 мл. рН среды 7,2-7,4, стерилизация 121 С в течение 30 мин. Штамм культивируют на чашках Петри в течение 72 ч при температуре 25 С. Колонии на мясо-пептонном агаре мелкие, поверхностные, в диаметре до 1,5 мм, правильной круглой формы с гладким краем. Поверхность колоний гладкая, блестящая, профиль выпуклый, цвет желтовато-кремовый. Внутренняя структура (при слабом увеличении микроскопа) однородная. Пример 4. Агаризованная среда состава Агар-агар 20,0 г Сусло солодовое 7 Б до 1000 мл. Стерилизация 105 С в течение 30 мин. На 72 часу культивирования на чашках Петри с сусло-агаром при температуре 25 С штамм образует точечные, прозрачные поверхностные колонии, круглые, с гладким краем. Поверхность колоний блестящая, профиль плоский. Внутренняя структура (при слабом увеличении микроскопа) крупнозернистая. 2 5793 1 Физиолого-биохимические признаки штаммаБМП-98 Штамм сапрофит, факультативный анаэроб. Термически неустойчив. Способен расти в интервале температур от 18 С до 30 С. Оптимальная температура роста 241 С. Растет в интервале рН от 6,8 до 4,5. Оптимальный рН среды для образования декстрана находится в пределах 6,0-5,0. Штамм БМП-98 превращает сахарозу в декстран, предварительно расщепляя ее на глюкозу и фруктозу. Побочным продуктом брожения является молочная кислота. Ферментирует ксилозу, арабинозу, рафинозу, утилизирует аммонийные и аминные формы азота (пептоны, дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт). В присутствии сахарозы связывает неорганический фосфор. Культура сохраняет жизнеспособность в течение 2 лет в лиофилизированном состоянии. Штамм БМП-98 не патогенен, не обладает аллергенным действием, устойчив к посторонней микрофлоре. Техническим результатом изобретения явилось получение штамма с высокой производительностью процесса биосинтеза декстрана при укороченном цикле ферментации. Изобретение поясняется примерами 5 и 6. Пример 5. Крупную изолированную колонию с агаризованной среды (пример 1) бактериологической петлей вносят в жидкую среду для культивирования штамма. Посевная среда для культивирования 1. КС 0,1 г 2. 4 0,1 г 3. КН 2 Р 4 1,0 г 4. 2412 Н 2 О 2,5 г 5. 4 0,5 г 6. Соль Мора 0,01 г 7. Парааминобензойная кислота 0,05 г 8. Пептон 0,2 г 9. Сахар-рафинад 100 г 10. Вода дистиллированная до 1000 мл. Для приготовления среды используют чистые соли и бидистиллированную воду. Компоненты растворяют в подогретой воде в указанном порядке. После растворения доводят объем водой до 1000 мл. Затем проверяют рН (должен быть 6,60,2) и содержание сахара(9,50,5) . Приготовленную среду фильтруют через двойной бумажный фильтр и разливают в стерильные пробирки по (111) мл. Среду, разлитую в пробирки, стерилизуют в автоклаве 30 мин при температуре 120 С. После стерилизации среда должна быть прозрачной. Приготовленную среду выдерживают по трое суток последовательно при температурах 37 С и 24 С соответственно для установления ее стерильности. Посевной материал выращивают при температуре 241 С в течение 24 ч, после чего в количестве 10 мл вносят в колбу Эрленмейера с ферментационной питательной средой. Ферментационная питательная среда состава 1. КС 0,1 г 2. 4 0,1 г 3. КН 2 РО 4 1,5 г 4. 2412 Н 2 О 4,4 г 5. 4 0,5 г 6. Соль Мора 0,01 г 7. Парааминобензойная кислота 0,05 г 8. Пептон 0,3 г 9. Сахар-песок 100 г 3 5793 1 10. Дрожжевой экстракт 0,01-0,03 г 11. Вода дистиллированная до 1000 мл. Порядок приготовления данной среды аналогичен описанному выше для посевной среды. рН среды 6,26,8. Среду, разлитую в колбы по 500 мл, стерилизуют в автоклаве 30 мин при 120 С. Ферментацию ведут при температуре 241 С в течение 52 ч, после чего определяют содержание декстрана весовым методом после двукратного осаждения этиловым спиртом пробы культуральной жидкости. Декстранобразующая способность штамма БМП-98 составляет 37,5 от количества сахара в питательной среде при продолжительности ферментации 52 ч. Пример 6. Ферментационная питательная среда состава 1. КС-0,1 г 3. КН 2 РО 4 1,5 г 4. 24122 4,4 г 5.4 0,5 г 6. Соль Мора 0,01 г 7. Пептон 0,3 г 8. Сахар-рафинад 100 г 9. Дрожжевой экстракт 0,2-0,3 г 10. Вода дистиллированная до 1000 мл. Способ приготовления среды, выращивание посевного материала, ведение процесса ферментации, определение ДОС в соответствии с примером 5. Сравнительная декстранобразующая способность штаммов СФ-4 и БМП-98 в условиях, описанных в примерах 5 и 6, представлена в таблице. ДОС штаммов СФ-4 и БМП-98. Выход (в ) декстрана Продолжительность ферментации (в ч) Выделяют декстран из культуральной жидкости осаждением этиловым спиртом при рН от 6,0 до 6,4. Водно-спиртовый маточник декантируют, осадок растворяют в воде до концентрации 67 и проводят очистку декстрана повторным спиртовым осаждением. Продукт жизнедеятельности культурыштамм БМП-98 - полисахарид декстран (-1, 6-глюкан) является субстанцией в производстве плазмозамещающих препаратов гемодинамического и реологического ряда - полиглюкина, реополиглюкина, полиглюсоля, реоглюмана, неорондекса, рондферрина, спейсферрона - препаратов - гемокорректоров,использующихся при лечении шоков различного происхождения - травматического, ожогового,геморрагического и для лечения железодефицитных анемий. ШтаммБМП-98 депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов концерна Белбиофарм, регистрационный номер В 18-1 от 20.11.98 г. Культура используется в производстве плазмозамещающих препаратов на АО Белмедпрепараты. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4