Штаммы молочнокислой бактерий Lactobacillus acidophilus и композиция против диареи

Изобретение относится к биологически чистой культуре штамма молочнокислых бактерий, а также к композиции, содержащей этот штамм и предназначенной против диареи.Документ ЕР 199 535 (Горбах и Г ольдин) предлагает штамм бактерий, идентифицированный в первой инстанции как Ьасторасйпиэ (Ц асйоорпйдоз,но затем как более похожий на сазей подвид гатпозоз (см. М. ЗНуа и др. в журнале Антимикробные агенты и хемотерапия, 31, Мо. 8, 12311233,1987), который демонстрирует хорошую адгезию к клеткам слизистой оболочки тонких кишок и который подходит для терапевтического применения. Этот штамм, названный штамм 66 и депонированный в АТСС (Атепсап Туре Сопоте СоНестЕоп) под номером 53 103, может использоваться в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, особенно в пищевых продуктах, прежде всего в кисломолочных продуктах типа йогурта.Другие штаммы того же типа давно уже использовались в аналогичных продуктам и с аналогичными целями. Однако существует потребность в особо эффективных штаммах этого типа, которые можно было бы легко идентифицировать и которые имели неоспоримые преимущества и обогатили выбор имеющихся штаммов.Задача изобретения состоит в том, чтобы удовлетворить указанную потребность.Для этого изобретение предлагает биологически чистые культуры штаммов молочнокислой бактерии,выбранной за ее способность внедряться в кишечную флору, за ее адгезию к клеткам кишечника,за ее способность соревновательного вытеснения болезнетворных бактерий из кишечных клеток и за способность к иммуномодуляции и/или снижению фекальной энзимной активности.Эти штаммы особенно пригодны для назначения людям и животным для терапевтического и профилактического лечения расстройств желудочнокишечного тракта, а именно в качестве средства против диареи. Штамм может назначаться в форме биологически чистой культуры, например, как таковой или после ее замораживания или высушивания при низкой температуре. Такая культурав 1 о может содержать, например, 10 10 сГи живых микробов (шт-единица, названная по первым буквам английского выражения союпу тогтйпг приз колониеобразующих единиц) на 1 грамм жидкойили замороженной культуры и 109 101 1 сш/ г для высушенной замораживанием культуры.Штамм может таюке назначаться в форме композиции, содержащей культуру и съедобный носитель, конкретнее фармацевтически приемлемый носитель или пищевой продукт, такой как кислое молоко, или еще лучше йогурт, или порошковая композиция на основе молока.Таким образом, изобретение предлагает культуру штамма кисломолочной бактерии, выбранную за ее СПОСОбНОСТЬ соревновательного вытесненияболезнетворных бактерий, возбудителей диареи, из кишечных клетокСреди различных штаммов выбранных таким образом бактерий, выделенных, в частности, из кисломолочных продуктов, особенно коммерческого йогурта, или из коммерческих культур, предназначенных для приготовления таких молочных продуктов или, например, из экскрементов младенцев,несколько было зарегистрировано согласно Будапештскому договору (30692) в Национальной коллекции культур микроорганизмов (СМСМ) Пастеровского института (28 Кие ое Вт. Коих, 75 724,Рагйз Сеоех 15), Франция, где каждый из них лолучил соответствующий номер СМСМ. В частности,был зарегистрирован штамм асйоорлпиз СМСМ 1225.Изолирован, имеет форму довольно коротких и толстых палочек- Другие характеристики катализа выделение 002 гидролиз аргинина .Подробности частных свойств, по которым данный штамм был выбран, приводятся ниже.Каждую из двух групп аксеничных мышей(мышей без кишечной флоры) ассоциировали с человеческой флорой различных доноров с получением гнотоксеничных мышей. Через несколько дней, необходимых для акклиматизации, кишечная флора мышей была полностью сопоставима с флорой людей-доноров с функциональной, качественной и количественной точек зрения.По изобретению были испытаны многие штаммы на их способность колонизировать пищеварительный тракт этих мышей с человеческой флорой, т. е. на их способность внедряться в эту кишечную Флору.Оказалось, что большинство штаммов неспособны колонизировать кишечник этих животных даже ПОСЛЕ многократных ПОСПЭДОВЗТЕЛЬНЫХ прививок, тогда как 1. асоорпйиз СМСМ 1225,например, мог размножаться и внедряться в пищеварительный тракт, т е. в кишечную флору мышей двух групп даже после однократной приВИВКИ, ЭТЗ КОЛОНИЗЭЦИЯ ИЛИ внедрение ПОЗВОЛЯЕТ штамму ПрИСуТСТВОВЗТЬ В ЭКСКРЕМЭНТЭХ В КОПИЧЭСТВЭболее 106 ста/грамм. Такое содержание живых микроорганизмов в экскрементах может считаться необходимым и/или достаточным для того, чтобы метаболизм штамма мог модифицировать метаболизм хозяина.Оказалось также, что имплантация сохраняется до тех пор, пока не изменится окружающая среда животныхАксеничные крысы ассоциируют для получения гнотоксеничных крыс с изолированным штаммом Вастегойоез тпетайотатйсгол П 1 из частной коллекции Центра исследований фирмы Нестек СА(СН-10 О 0, Лозанна, Швейцария) кишечной флоры здоровья донора, выбранного, как будет видно из дальнейшего, для имитации продуцирования энзимов полной фекальной флоры человека. Эта ассоциация дает в результате обильную колонизацию кишечного тракта этих крыс, так что бактерия присутствует в экскрементах в количестве прибли зительно 108 сги/ грамм.Испытание имплантации штамма 1. асйоорлпиз СМСМ 1225 в эту флору дает в результате хорошую колонизацию, так что этот штамм присутствует в экскрементах в количестве приблизительноДля сравнения определяли количество живых микроорганизмов 1. Ьшдагйсиз, появляющееся в экскрементах здоровых людей-добровольцев, которьте ели традиционный йогурт, приготовленный ферментацией коровьего молока с коммерческой культурой рщгагтсиз и 8. гпегторппизДобровольцы не употребляли в пищу никаких ферментированных молочных продуктов в течение трех последовательных периодов по три недели каждый, кроме йогурта, который они получали в течение второго трехнедельного периода.В течение трех недель, когда они получали йогурт, они каждый день принимали с ним примерно1010 ст штамма Ь рышапсиз, что приблизительно соответствует трем порциям йогурта по 120 г в день В течение периода потребления йогурта экскре менты добровольцев содержали примерно 105 сГи / грамм Ьшдалсиз.По изобретению было проведено испытание по такому же сценарию, что и выше, но с йогуртом,приготовленным ферментацией молока коммерческой культурой 5. тпегторппиз и В. Ьтбиз и дополнительно культурой асйборппиз СМСМ 1225 в концентрации того же порядка.Общее количество живых молочнокислых бактерий в экскрементах добровольцев определяли до,в течение и после периода потребления йогурта. Допотребления были получены величины 105 - 106 ста/грамм. в период потребления были полученыпотребления были получены величины 106 сТи/грамм.Соответственно, был обнаружен рост общего количества молочнокислых бактерий в экскрементах в течение периода потребления йогурта. Штамм СМСМ - 1225 был найден в значительном количестве и в живой форме у добровольцев. Напротив,этот микроорганизм исчезал через несколько дней после того, как добровольцы переставали есть йогурт.Уменьшение фекальной энзимной активностиФекальную азоредуктазную и нитроредуктазную активность определяли в испытаниях на гнотобиотичных крысах, упомянутых выше, поскольку энзимы азоредуктаза и нитроредуктаза участвуют в образовании канцерогенных веществ. Высокая концентрация этих энзимов повышает рискзаболевания раком прямой кишки.Оказалось, что фекальная энзимная активность гнотобиотичных крыс с Вастегобоез достигала 2,5 мкг/ч/мг протеина для азоредуктазы и до 4,2 мкг/ч/ мг протеина для нитроредуктазы, тогда как у гнотобиотичных крыс с Вастегошез во флоре, в которую был внедрен штамм СМСМ 1 - 1225, энзимная активность достигала 1,8 мкг/ч/мг протеина для азоредуктазы и 3,5 мкг/ч/мг протеина для нитроредуктакзы.Кроме того, оказалось, что гнотобиотичные крысы с кишечной флорой, образованной исключительно штаммом СМСМ 1225, вообще не локазали никакой фекальной азоредуктазной или нитроредуктазной активности.Другими словами, присутствие штамма СМСМ 1225 во флоре гнотобиотичных крыс вызывает снижение производства некоторых нежелательных энзимов у этих ясивотных, т. е. благоприятно влияет на метаболизм хозяина.Фекальную нитроредуктазную активность определяли в испытаниях на людях-добровольцах Эту активность определяли за несколько дней до периода потребления йогурта со штаммом СМСМ 1225, в течение этого периода и первые несколько дней после него.Оказалось, что эта активность снизилась с 8,2 до 4,9 мкг/ч/мг протеина во время периода потребпения йогурта, оставалась на этом уровне примерно в течение одной недели после этого периода и затем прогрессивно увеличивалась.Люди-добровольцы воздерживались от потребления ферментированных молочных продуктов,кроме продуктов, предусмотренных следующейпрограммой молоко в течение трех недель,-йогурт,приготовленный ферментацией молока смешанной культурой коммерческого штамма 3. тегторнпцз и 1 асйоорппиз СМСМ 1 - 1225 в течение следующихтрех недель, и затем молоко в течение шести нет дель.Фагоцитозная способность лейкоцитов периферийной крови добровольцев определялась в начале и в конце каждого из этих периодов.Это определение предусматривало извлечение лейкоцитов из крови и приведение их в контакт с флюоресцирующими бактериями. Флюоресцентный свет, излучаемый лейкоцитами, которые поглотили флюоресцирующие бактерии, измеряли цитометрическим анализом в потоке ( с использованием устройства торговой марки Расзал) Процент лей коцитов, показывающих фагоцитозную активность, т. е. фагоцитозную способность, упомянутую выше, и определялся таким образом.Фагоцитозная способность лейкоцитов периферийной крови наблюдалась на уровне 36,5 в начале первого периода потребления (молока) и32,7 в конце этого периода, и, естественно, столько же в начале периода потребления йогурта, а в конце периода потребления йогурта было получено 518 и 514 через шесть недель после него, т. е. соответственно в конце второго и третьего периодов потребления.Вероятна статистическая ошибка (величина р) оценки увеличения фагоцитозной способности лейкоцитов составила менее 01.(группа испытания) питались по следующей программе в течение 2 недель (неделя 1 и 2) нор мапьная диета, исключая любые ферментированные продукты следующие три недели (неделя 3, 4 и 5) смешанная диета, содержащая три 125-граммовые порции йогурта, приготовленного ферментацией молока коммерческой культурой штамма 8. тлетторптшэ и Втообастегйит Ьтйоцз, к которым был добавлен штамм астаорлпиз СМСМ 1225 в ко личестве 107 108 сГи/ мл и еще две недели(неделя 6 и 7) нормальная диета, исключая любые ферментированные молочные продукты.Еще 14 здоровых людей-добровольцев (контрольная группа) одновременно нормально питались. исключая любые ферментированные продукты.Вивотивная оральная вакцина (Загттолеа гурт Ту 21 а), производимая фирмой Вегпа ЗА назначалась добровольцам двух групп соответственно с инструкцией предлрятияизготовителя в 1, 3 и 5 дни четвертой недели.Брали кровь для анализа от всех добровольцев через три дня после начала третьей недели и через 1 день и через 10 дней после окончания пятой недели.Определяли концентрацию иммуноспецифичных антител (3 А) на антигенные липопописахариды(ППС) 3 аггтопеа туры методом ЕЦЗАОбнаружено значительное повышение концентрации специфичных 3 А при наблюдении через 15 дней после вакцинации по сравнению с концентрацией, наблюдаемой за девять дней до вакцинации в двух группах (величина р более 0.001). Однако, если принять во внимание порядок ловышения концентрации в интервалах меньше 2, от 2 до 3, от 3 до 4 и больше 4, то в них наблюдается такое распределение - соответственно 1, 6, 3 и 6 добровольцев из группы испытания против 8, 3, 0 и 3 добровольцев из контрольной группы. Другими словами, общий рост концентраций в испытательной группе значительно выше, чем в контрольной группеПо изобретению излучали адгезию (прилипание) различных штаммов кисломолочных бактерий к клеткам кишечника, конкретнее к эпителиапьным клеткам Сасо-2 человеческого кишечника (См. М. Рдлто и др. Вйо. СеН. , 47, 323, 1983), и к клеткам слизистой оболочки кишечника человека НТ 29 МТХ(Ьезцтеиг и др. журнал Салсег Кез.50, 63346343) на однослойной культуре Ел что.ДЛЯ ЭТОГО КЛЕТКИ культивировали В ПЛЭСТМЭС совых бутылочках 25 смг фирмы Корнинг для поддержания линий клеток и на обезжиренных и стерилизованных стеклянных пластинках (22 х 22 мм), размещенных на шестичашечных поддонах(Корнинг) для испытания на прилипание.Для культивирования клеток Сасо-2 и НТ 29 МТХ среду, начиная со второго дня после пересева,приходилось менять каждый день. Среду готовили из минимально необходимой сухой среды фирмы Еаше, модифицированной ВиЬессо (ВМЕМ).Молочнокислые бактерии культивировали в анаэробных условиях на среде МКЗ из замороженных культур. Использовали бактерии из второй субкультуры.Смешанную среду для инкубации на клетках готовили смешиванием 50 среды ВМЕМ без антибиотика и 50 среды МНЗ, в которой бактериивыращивались, эта среда содержала 108 сто молочнокислых бактерий или бифидобактерий (см. Шовьер Г. и др. РЕМС Мбсгорйы. Ьег 91, 213-218. 1992).Для проведения испытания на прилипание смешанную среду, содержащую бактерии, помещали на ткань клеток кишечника и инкубировали в течение 1 часа при доступе воздуха. Многочашечные поддоны промывали пять раз, каждый раз с двадцатью круговыми помешиваниями, чтобы удалить неприставшие бактерии промывкой. Клеточную ткань в виде полосок затем фиксировали в последовательных ваннах с метанолом 10 мин при 70, 10 мин при 95 и 15 мин при 100 и окрашивали по Граму или Гимзе. Уровень прилипания определяли подсчетом прилипших бактерий под микроскопом.Среди многочисленных проверенных на прилипание штаммов некоторые штаммы показали хороший уровень прилипания к клеткам кишечника. по данным этих испытаний на клетках Сасо 2.Так, штамм астоорттпиэ СМСМ 1-1225, который приставал к клеткам Сасо 2 на уровне примерно 15 О 23 бактерий на 100 клеток Сасо 2. Такой результат обозначили как . Испытания на приставание штамма Ь астаорнпиз СМСМ 1-1225,например, к клеткам НТ 29-МТХ дало даже еще более удачные результаты.Неожиданно было обнаружено, что приставание этого штамма к клеткам кишечника объясняется секретом, который он выделяет в своей среде культивирования (например, в МНЗ или в молоке). Таким образом, когда процесс инкубации в течение 1 часа на Сасо 2 был проведен на штаммах асйоорппиз СМСМ-1225 без среды его культивирования, то наблюдалось значительное уменьшение прилипания.Кроме того, если процесс инкубации проводился на Сасо 2 с этим штаммом и его средой культивирования, подвергнутыми предварительно воздействию трипсина, опять наблюдалось значительное уменьшение приставания. Это, по-видимому,ДОКЗЗЫВЗЭТ, ЧТО СЕКРЭТОМ, выделяемым ЭТИМСоревновательное исключение патогенных бактерий.По данному изобретению были исследованы различные штаммы молочнокислых бактерий на их способность соревновательного исключения из кишечных клеток патогенных бактерий, в особенности бактерий, ответственных за диарею.В частности, изучали исключение некоторых сапрофитных штаммов Е сот из кишечного тракта людей и животных, которые могут размножиться и стать болезнетворными, а именно энтеротоксиногенной Е сот (ЕТЕС), энтеропристающей Е сот (ВАЕС) и энтеролатогенной Е сот (ЕРЕС), и исключения штамма атопеа турлт-тигтит.для ЕРЕС штамм ЛРМ 15 Р МАК 7, который выражает ЕАР и еае (коллекция проф. Дж Кзйпера,Центр разработки вакцин, Мерилендский университет, медицинский факультет, 10 Саут Пайн Стрит,Балтимора, Мэриленд 21201, США)(Др Б. Стокер, Стэнфордский университет, медицинский факультет, кафедра микробиологии и иммунологии, Шерманн Сэйрчайльд Сайенс Билдинг,)В 333 Стэнфорд, Калифорния 94305-5402,США.Кратко, монослои клеток Сасо 2 дважды про мывали солевым фосфатным буферным раствором(ФБР). Меченные изотопом С 1 4 Е сот или изотопом 35 атопеа диспергировались в с еде ль ры КУ у ТУв количестве 108 сГи/мл и по 2 мл суспензии до бавляли в каждую чашку, содержащую стеклышко с культурой клетокДля Е сот все инкубации проводили в присутствии однопроцентной В-маннозьт. Для опре деления уровня (или фактора) исключения, т. е. пропорции патогенных бактерий, которым помешали пристать к клеткам Сасо 2 молочнокислые бактерии,занявшие их место, добавляли 1 мл суспензии, содержащей 108 сто/мл меченых патогенных бактерий и 1 мл суспензии, содержащей либо 108, либо 109 сти/ мл штамма мопочнокислой бактерии к каждой чашке, содержащей стеклянную пластинку, несущую культуру клеток Пластинки инкубировали в течение 1 часа приМонослои клеток промывали 5 раз стерильным ФБР. Приставшие бактерии и кишечные клетки растворяли в 0,2 н. растворе едкого натра. Количество меченых прилипших бактерий оценивали подсчетом сцинтилляций в жидкости.Среди различных штаммов молочнокислых бактерий, испытанных таким образом по их свойствам или по их способности соревновательного исключения (вытеснения) патогенных бактерий,штамм по изобретению дал замечательные результаты, которые представлены в следующей таблице, которая показывает в процентах уровни исключения, достигнутые штаммом, испытанным наПОДЗВПЕНИЗ ПЗЗЛИЧНЫХ ПЭТОГЕННЫХ ШТЭММОВ, ИСПОЛЬЗОВЭННЫХ В ЭТОМ ИСПЫТЭНИИ.