Штамм гриба Lecanicillium (Verticillium) lecanii БИМ F-368Д для получения препарата для защиты растений от персиковой тли

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ-368 Д ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ ПЕРСИКОВОЙ ТЛИ(71) Заявитель Республиканское научное дочернее унитарное предприятие Институт защиты растений(72) Авторы Прищепа Людмила Ивановна Микульская Наталья Игнатьевна Герасимович Марина Станиславовна Угначева Екатерина Витальевна(73) Патентообладатель Республиканское научное дочернее унитарное предприятие Институт защиты растений С 1, 1995.2150836 С 1, 2000. ПАВЛЮШИН В.А. Пути дальнейшего совершенствования защиты растений в республиках Прибалтики и Белоруссии. Тез. докл. научно-производственной конференции. Ч. . Вредители сельскохозяйственных культур и леса и меры борьбы с ними. - Рига, 1983. С.134-136. БОЙКОВА И.В. и др. Защита растений Сб. научн. тр. Вып. 30, Ч. . Стратегия и тактика защиты растений. Материалы научной конференции. Минск, 2006. - С.453-456. МИТИНА Г.В. и др. Защита растений на рубежевека. Материалы научно-практической конференции. - Минск,2001. - С.412-414.(57) Штамм грибас БИМ -368 Д для получения препарата для защиты растений от персиковой тли. Изобретение относится к области биотехнологии, к производству средств защиты растений, касается нового штамма гриба, может быть использовано для производства грибных энтомопатогенных препаратов для защиты растений от персиковой тли. Штамм(.).-1 был получен из погибших особей тли с последующим отбором по признаку вирулентности в отношении персиковой тли. Штамм энтомопатогенного гриба(.). , обладающий инсектицидной активностью, для производства энтомопатогенного препарата для защиты растений от вредителей депонирован в коллекции непатогенных микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси за номером БИМ -368 Д. Известны штаммывирулентные для трипсов 5, 9. Известны штаммы, эффективные против тепличной белокрылки 4, 7, 8 и обладающие незначительной энтомоцидной активностью по отношению к персиковой тле (3050 ) 6. Известен штамм, эффективный против бахчевой тли 2. Однако у указанных штаммов отсутствует вирулентность по отношению к персиковой 12755 1 2009.12.30 тле. Технической задачей изобретения является получение штамма . , высокоактивного против персиковой тли. Штамм .имеет следующие характеристики морфолого-культуральные признаки изучали на следующих питательных средах сусло-агар, картофельно-пептонный агар, картофельно-глюкозный агар, Сабуро, Чапека. Описание колоний проводили на 14-е сутки роста при температуре 26 С. На среде сусло-агар штамм образует белые колонии правильной круглой формы. Край колоний реснитчатый, профиль выпуклый. Консистенция бархатистая. Обратная сторона интенсивно-оранжевая. Центр колоний, вросший в субстрат. На картофельно-глюкозном агаре образуются колонии белого цвета, круглой формы. Край истонченный, реснитчатый, четко-ограниченный. Профиль изогнутый, в центре кратерообразное вдавление с валиком. Консистенция бархатистая. Обратная сторона песочная, центр, вросший в субстрат. На картофельно-пептонном агаре образуются белые колонии неправильной округлой формы. Колония разделена на сектора, в центре иногда отмечается конусовидное возвышение. Слабо выражена концентричность колоний. Край четкий фестончатый с валиком. Консистенция колоний плотная, профиль плоский. Окраска с обратной стороны кремовая,центр, вросший в субстрат. На среде Сабуро колонии круглые, иногда с небольшим вдавлением в центре. Край истонченный, четко ограниченный, реснитчатый. Профиль выпуклый. Консистенция ватообразная, реснитчатая. Цвет белый. Обратная сторона оранжевого цвета. В центре колония прорастает в субстрат. На среде Чапека штамм образует белые колонии правильной округлой формы со слабовыраженной концентричностью. Край расплывчатый, реснитчатый. Консистенция ватообразная, пушистая. Профиль выпуклый. Обратная сторона колоний светло-желтого цвета, в центре более ярко окрашена и прорастает в среду. Физиолого-биохимические признаки оптимальной агаризованной средой для хранения и размножения гриба является сусло-агар, табл. 1. Таблица 1 Влияние температуры и состава агаризованной среды на рост и интенсивность спороношения-1 ТемпераОбразование Среднее значетура мицелия на Диаметр коПродуктивность,Питательная ние ростового культиповерхности лонии (мм),спор/см 2,среда коэффициента вировапитательной 14-е сутки 14-е сутки 12755 1 2009.12.30 Для оценки влияния температуры и освещенности на продуктивность штамм выращивали на среде сусло-агар в пробирках в термостате. После засева чистой культурой пробирки помещали в термостат без освещения и в термостат с дневным освещением. Изучали влияние следующих температур - 6 С, 18 С, 26 С, 36 С. Результаты исследований представлены в табл. 2. Таблица 2 Продуктивность-1 на сусло-агаре в зависимости от освещенности и температуры Температура куль- Начало роста, сутки Титр спор, млрд. спор/мл тивирования на свету в темноте 6 С 6 1,3 0,6 18 С 3 2,3 0,7 28 С 2 4,2 0,8 Установлено, что-1 способен расти в пределах температур от 4 до 30 С. Оптимальной температурой для культивирования штамма является 26 С. При температуре 36 С не наблюдали роста мицелия и спороношения гриба. При выращивании на свету титр препарата был значительно выше, чем в темноте. Для массового культивирования препарата можно использовать прозрачные емкости, а также помещение с обычным освещением. Способ пересева и хранение продолжительность выращивания на косяках среды сусло-агар - 14 суток, после чего штамм хранится в холодильнике (температура 4 С) без пересевов в течение 6 месяцев. Инсектицидная активность штамма выявлена по отношению к персиковой тле. Штамм поражает как имаго, так и личинок вредителя. При инфицировании на насекомых отмечается белый пушистый мицелий, что может служить условием для дальнейшего распространения и циркуляции патогена в популяции вредителя. Начало гибели отмечали на 5-е сутки после обработки. На личинках и имаго персиковой тли мицелий .бархатистый, плотный, белый. Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для получения препарата против персиковой тли не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения новизна и изобретательский уровень. Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения. Пример 1. Способ приготовления препарата на основе .методом твердофазного культивирования. Исследование по подбору оптимального состава питательной среды для выращивания .твердофазным способом провели по двум основным показателям продуктивность (количество спор) и начало спорообразования. В качестве основного компонента среды использованы отходы ячменя от производства трихограммы. Добавки (1 хитин, 4 крахмал, 10 сахароза, 10 глицерин, 3 кукурузный экстракт, 3 меласса, 3 барда, 5 К 24, 24, 2, смесь 10 глицерина 25 сахарозы) подбирали в процентном соотношении к основному компоненту. В опытах изучали различные композиции твердых питательных сред. Компоненты смешивали в определенных соотношениях. 50 г среды засыпали в 0,5 литровые бутыли, в каждую из которых наливали по 110 мл воды, выдерживали в течение 5 часов и стерилизовали в автоклаве 60 минут при давлении 1,5 атм. После засева сред чистыми культурами гриба бутыли помещали в термостат, выдерживали 14 суток при температуре 26 С, затем определяли титр спор. На всех испытанных средах рост мицелия отмечался на 2-е сутки после посева. 12755 1 2009.12.30 Хороший рост отмечен при выращивании штамма на среде из отходов ячменя от производства трихограммы с добавлением смеси из 10 глицерина, 2, 5 сахарозы,табл. 3. Титр спор полученного препарата в среднем составлял 12,4108 спор/г. Таблица 3 Влияние добавок на продуктивность-1 при твердофазном культивировании Состав питательной среды Контроль, 100 ячмень Ячмень 10 сахароза Ячмень 4 крахмал Ячмень 10 глицерин Ячмень 1 хитин Ячмень 3 меласса Ячмень 3 кукурузный экстракт Ячмень 3 барда Ячмень 24 Ячмень 2 Ячмень 524 Ячмень 10 глицерин, 2, 5 сахароза Пример 2. Определение биологической активности и ЛК 50 штамма по отношению к персиковой тле на томате. Для определения биологической активности биопрепарата леканицил в теплице провели обработки против персиковой тли (в очагах) на растениях томата сорта Добрунь. Листья, заселенные тлей, этикетировали и после обработки на них надевали изоляторы. Эксперименты проведены в 4-х повторностях. Рабочую суспензию готовили путем смыва спор водой с зернового препарата с последующим определением титра. Растения томатов, заселенные вредителем, опрыскивали однократно. В контрольном варианте растения обрабатывали водой. Перед обработкой, на 7-е и 14-е сутки после проводили учеты численности насекомых. Биологическую активность определяли по формуле Франца 3. Результаты исследования представлены в табл. 4. Таблица 4 Биологическая активность-1 по отношению к персиковой тле Титр рабочей суспензии,Биологическая эффективность с поправкой на контроль,8 7 сутки 14 сутки 110 спор/мл 8,8 72,9 94,7 4,4 77,3 97,5 3,3 41,6 51,0 2,2 62,2 19,7 1,6 45,7 18,9 0,8 0 0 Определение ЛК 50 проводили по формуле Штейнхауза 1 50-в где х - ЛК 50 А - показатель гибели насекомых выше 50 В - показатель гибели насекомых ниже 50 а - титр спор, вызывающий гибель насекомых выше 504 12755 1 2009.12.30 в - титр спор, вызывающий гибель насекомых ниже 50 . Установлено, что ЛК 50 -1 при благоприятных для развития гриба условиях для личинок персиковой тли составляет 3,2108 спор/мл. Пример 3. Определение биологической эффективности штамма против персиковой тли на баклажане. В теплицах проводили очаговые обработки на отдельных растениях. Листья, заселенные тлей, этикетировали и после обработки на них надевали изоляторы. Эксперименты проведены в 4-х повторностях. Рабочую суспензию готовили путем смыва спор дистиллированной водой с зернового препарата с последующим определением титра, который составил 2 млрд. спор/мл. В качестве препарата сравнения применяли биопрепарат фитоверм, 0,2 к.э. в концентрации 0,8 . Растения баклажана, заселенные вредителем, опрыскивали однократно. В контрольном варианте растения обрабатывали водой. Перед обработкой и на 5-е и 10-е сутки после проводили учеты насекомых. Эффект действия образцов на основе различных штаммов оценивали по снижению численности тлей до и после обработки по формуле Франца. Результаты опыта представлены в табл. 5. Таблица 5 Биологическая эффективность-1 по отношению к персиковой тле(полевой опыт, 2006 г.) Титр рабочей сус- Численность персиковой тли Биологическая акна дату учета, экз. тивность с попензии, млрд. правкой на Вариант спор/мл конценДо После контроль,трация препара- обработки обработки та,9,08 15,08 21,08 15,08 21,08 Штамм -1 4 121 12 3 95,7 99,2 Фитоверм, 0,2 к.э. 0,8 50 0 3 100,0 98,0 Контроль вода 36 83 106 Высокая инсектицидная активность и продуктивность в условиях массового культивирования штамма(.).-1 позволяют использовать его в качестве продуцента биопрепарата, предназначенного для защиты растений от персиковой тли. Источники информации 1. Король И.Т. и др. Бактериальные препараты для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур рекомендации / МСХ БССР, БелНИИЗР. - Минск Ураджай, 1984. С. 20. 2. Бегляров Г.А., Пономарева И.А., Назарова В.А. Опыт практического применения грибадля борьбы с тлями в защищенном грунте / Производство и применение грибных энтомопатогенных препаратов Сб. науч. тр. - Москва, 1985. ГУМП при СМ СССР, ОРИС. - М., 1985. - С. 90-92. 3. Заборский Н.И. и др. Методические указания по испытанию биопрепаратов для защиты растений от вредителей, болезней и сорняков методические указания / Под ред. Н.И. Заборского. - М. Колос, 1973. - С. 41. 4. Митина Г.В., Сергеев Г.Е., Павлюшин В.А. Влияние биохимических и морфологокультуральных особенностей природных изолятов(.)на вирулентность в отношении личинок оранжерейной белокрылки / Микология и фитопатология. - 1997. - Т. 31. - В. 1. - С. 57-64. 5. Митина Г.В., Нефедов В.В., Наумов В.А. Эффективность различных препаративных форм биопрепаратов на основе дейтеромицетови 5 12755 1 2009.12.30 против трипсов. Защита растений на рубежевека мат. науч.-практ. конф., посвященной 30-летию БелНИИЗР. - Минск-Прилуки, 19-21 фев. 2001. МСХП РБ, ААН РБ, БелНИИЗР. - Минск, 2001. - С. 412-415. 6. Павлюшин В.А., Патогенность мускардинных грибов на тлях и оранжерейной белокрылке. Пути дальнейшего совершенствования защиты растений в республиках Прибалтики и Белоруссии, Ч. 1, Вредители сельскохозяйственных культур и леса и меры борьбы с ними тез. докл. науч.-производств. конф. - Рига, 1983. ЗОВАСХН им. Ленина, МСХ ЛССР, ПНО Латсельхозхимия. НТОСХ ЛССР. Прибалтийский филиал ВИЗР. - Рига,1983. - С. 134-136. 7. Романовец З.А., Касперович Е.В., Будько А.В. Научно-практические принципы производства вертициллина и его эффективное использование в Белоруссии // Биологический метод защиты растений. Тез. докл. науч.-практ. конф. - Минск 18-19 апр. 1990. ЗРОВАСХН им. Ленина, БелНИИЗР, БелРПВАП НТО. - Минск, 1990. - С. 166-167. 8. Соловей Е.Ф. Об особенностях культивирования и применения грибапротив оранжерейной белокрылки. Биологический метод борьбы с вредителями. Биологический метод борьбы с вредителями и болезнями растений в защищенном грунте тез. докл. совещ. - Рига, 2-6 окт. 1983. ВОЛиОТКЗАСХН им. Ленина, ИБАНЛССР. - Рига,1983. - С. 81-82. 9..,,,.,.,/. - 1995. -5. - . 185-192. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6