Консорциум штаммов Rhodococcus erythropolis и Rhodococcus ruber – деструкторов триэтиламина для очистки сточных вод

КОНСОРЦИУМ ШТАММОВИ- ДЕСТРУКТОРОВ ТРИЭТИЛАМИНА ДЛЯ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Самсонова Алисса Самуиловна Алещенкова Зинаида Михайловна Семочкина Наталья Федоровна Петрова Галина Михайловна Рылюк Виктория Владимировна Шаповалов Юрий Петрович Галибус Александр Сергеевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Консорциум штаммовБИМ В-301 Д иБИМ В-300 Ддеструкторов триэтиламина для очистки сточных вод. Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для очистки сточных вод металлургических заводов и предприятий органического синтеза. Известен способ обезвреживания сточных вод, содержащих ароматические амины,включает обработку нитритом натрия при 15-25 С, нейтрализацию продукта, подвергнутого процессу диазотирования, фильтрацию, разбавление водой и направление на биологическую очистку активным илом 1. Физико-химическая предобработка сточных вод является трудоемкой и дорогостоящей. Очистка воды с помощью активного ила сопряжена с двумя проблемами необходимостью повышения деструктивной активности илового ценоза в условиях увеличения содержания токсических веществ и неизбежностью утилизации накапливающихся избыточного активного ила и осадков сточных вод. Преимущество локальной микробной очистки основано на использовании высокоактивных штаммов микроорганизмов-деструкторов, более устойчивых к токсическому действию ингредиентов сточных вод, чем компоненты активного ила, и поэтому находит применение для очистки сильнозагрязненных сточных вод 2, 3. Задачей предлагаемого изобретения является получение новых штаммов микроорганизмов, способных полностью разлагать триэтиламин (ТЭА) в высокой концентрации при локальной очистке содержащих его сточных вод. 8474 1 2006.10.30 Для достижения поставленной задачи методом накопительной культуры из почвы, загрязненной ингредиентами выбросов предприятия органического синтеза в естественных условиях, получен штамм 37 Ф ЛЭМ В-1189, а из активного ила очистных сооружений выделен штамм 2 ЛЭМ В-1546. Штаммы депонированы в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов (Научной коллекции типовых и промышленноценных непатогенных микроорганизмов Института микробиологии Национальной академии наук Беларуси), где им присвоены коллекционные номера БИМ В-301 Д и БИМ В-300 Д соответственно. ШтаммБИМ В-301 Д имеет следующие свойства. Морфолого-культуральные свойства. Грамположительные клетки образуют на ранней стадии развития рудиментарный мицелий, который в дальнейшем распадается на фрагменты, превращающиеся в результате ряда последовательных делений в палочки, а затем в кокки. Рост на плотных средах мясо-сусловый агар, 29 С, 3 суток штрих кремово-розовый, матовый, пастообразный колонии кремово-розовые, диаметром 2,5 мм, круглые с ровным краем, выпуклые,гладкие, пастообразные сусло-агар, 29 С, 5 суток штрих кремовый, матовый, пастообразный колонии кремовые, диаметром 1,5 мм, круглые, выпуклые, с ровным краем, гладкие,матовые, пастообразные минеральная агаризованная среда, г/л- 0,5 472 - 0,8 КН 2 РО 4 - 0,7 (4)24 - 1,5 агар-агар - 20,0 ТЭА 0,5 рН 7,3-7,5 29 С, 14 суток штрих кремовый, матовый, пастообразный колонии кремовые, диаметром 1 мм, круглые, выпуклые, с ризоидным краем, матовые,пастообразные. Рост на жидких средах мясо-пептонный бульон, 29 С, 7 суток характер роста - пленка, кремовый осадок жидкая минеральная среда, г/л- 0,5 4-72 - 0,8 КН 2 РО 4 - 0,7 (4)24 - 1,5 ТЭА-0,5 рН 7,3-7,5 29 С, 14 суток характер роста - кремовый осадок, изменение среды не наблюдается. Физиолого-биохимические свойства. Аэроб, некислотоустойчив, оксидазоотрицателен, имеет каталазу, уреазу, не имеет ДНК-азу и нитратредуктазу, анаэробный тест Хью-Лейфсона с глюкозой отрицательный,желатин не разжижает, крахмал не гидролизует, казеин не разлагает. Образует кислоту из глюкозы, фруктозы, галактозы, ксилозы, мальтозы, глицерина, но не использует арабинозу, сахарозу, лактозу, рамнозу, дульцит, маннит и сорбит на среде, г/л пептон -3,02,5 2 мл 1,6 -го спиртового раствора бромтимолового синего. Усваивает натриевые соли органических кислот лимонной, пропионовой, бензойной, молочной, уксусной, - кетоглутаровой, циса-конитовой, но не щавелевой на среде, г/л (4)24 - 0,5 472 - 0,2- 0,1 агар-агар - 15,0 органическая кислота - 2,0 20 мл 0,04 -го водного раствора фенолового красного, рН 6,8. Растет на нитритном агаре, на безазотистой среде Эжби, в присутствии 5. В клеточной стенке обнаружены галактоза, арабиноза,мезодиаминопимелиновая кислота (мезо-ДАПК), липид - ( тип). Штамм при росте на общепринятых средах и минеральной среде с ТЭА не требует стимуляторов роста. Штамм потребляет триэтиламин в качестве единственного источника углерода и не требует стимуляторов деструкции сохраняет жизнеспособность и деструктивные свойства в тече 2 8474 1 2006.10.30 ние 6 месяцев на МПА, МСА и агаризованной минеральной среде с ТЭА (0,5 ). ШтаммБИМ В-301 Д не токсичен и не патогенен. ШтаммБИМ В-300 Д имеет следующие свойства. Морфолого-культуральные свойства. Грамположительные клетки образуют на ранней стадии развития первичный мицелий,который к 24-30 ч роста фрагментируется и колонии 2-3 суточного возраста состоят из кокковидных овальных клеток. Рост на плотных средах мясо-сусловый агар, 29 С, 3 суток штрих оранжево-красный, сухой, неблестящий колонии оранжево-красные, диаметром 1-5 мм, круглые с ровным краем, выпуклые,неблестящие, сухие, легко снимаются с агара сусло-агар, 29 С, 5 суток штрих оранжевый, маслянистый, пастообразный колонии оранжевые, диаметром 2 мм, круглые, выпуклые, с ровным краем, гладкие,маслянистые, пастообразные минеральная агаризованная среда, г/л- 0,5 472 - 0,8 КН 2 РО 4 - 0,7 (4)24 - 1,5 агар-агар - 20,0 ТЭА 0,5 рН 7,3-7,5 29 С, 14 суток штрих бледно оранжевый, маслянистый, пастообразный колонии бледно оранжевые, диаметром 1 мм, круглые, выпуклые, маслянистые, пастообразные. Рост на жидких средах мясо-пептонный бульон, 29 С, 7 суток характер роста - пленка, оранжевый осадок жидкая минеральная среда, г/л- 0,5 472 - 0,8 КН 2 РО 4 - 0,7 (4)24 - 1,5 ТЭА-0,5 рН 7,3-7,5 29 С, 14 суток характер роста - оранжевый осадок. Физиолого-биохимические свойства. Аэроб, некислотоустойчив, оксидазоотрицателен, каталазо-положителен, анаэробный тест Хью-Лейфсона с глюкозой отрицательный, желатин не разжижает, казеин не разлагает, крахмал не гидролизует. Образует кислоту из глюкозы, фруктозы, сорбита, инозита,глицерина на среде, г/л пептон - 3,0- 2,5 2 мл 1,6 -го спиртового раствора бромтимолового синего. Хорошо ассимилирует цитрат, пропионат,- кетоглутарат, лактат,ацетат натрия, но не оксалат натрия на среде, г/л (4)24 - 0,5 4-72 - 0,2- 0,1 агар-агар - 15,0 органическая кислота - 2,0 20 мл 0,04 -го водного раствора фенолового красного, рН 6,8. Восстанавливает нитраты в нитриты, не имеет уреазы, растет в присутствии 7. В клеточной стенке содержатся галактоза, арабиноза, мезодиаминопимелиновая кислота (мезо-ДАПК), липид - ( тип). Штамм при росте на общепринятых средах и минеральной среде с ТЭА не требует стимуляторов роста. Штамм потребляет триэтиламин в качестве единственного источника углерода и не требует стимуляторов деструкции сохраняет жизнеспособность и деструктивные свойства в течение 6 месяцев на МПА, МСА и агаризованной минеральной среде с ТЭА (0,5 ). ШтаммБИМ В-300 Д не токсичен и не патогенен. Сущность предлагаемого изобретения поясняется следующими примерами выполнения. Пример 1. Посевной материал культурыБИМ В-300 Д выращивали в колбах Эрленмейера объемом 500 мл со 100 мл жидкой минеральной среды следующего состава (г/л)- 0,5 4-72 - 0,8 КН 2 РО 4 - 0,7 (4)24 - 1,5 ТЭА- 0,1 рН 7,3-7,5. Культуру вносили петлей с косяков, посевной материал инкубировали на качалке,3 8474 1 2006.10.30 обеспечивающей 180 об./мин при 29 С в течение 168 ч. Стеклянный биореактор объемом 1 л заполняли 200 мл полученного посевного материала культурыБИМ В-300 Д и жидкой минеральной средой выше указанного состава, добавляли ТЭА до конечной концентрации 1000, 3000 и 7000 мг/л, рН доводили до 7,3-7,5. Процесс разрушения триэтиламина вели при температуре 20 С и интенсивной аэрации (36 л/ч). Эффективность разрушения ТЭА в воде определяли по остаточному содержанию токсиканта до и после очистки. Содержание ТЭА контролировали фотометрическим методом(Лурье, 1984). Результаты фотометрического анализа остаточного количества ТЭА, представленные в табл. 1, показывают, что культураБИМ В-300 Д полностью разрушает токсикант в концентрации 1000,0 3000,0 и 7000,0 мг/л за 240, 360 и 384 ч соответственно. Таблица 1 Разрушение триэтиламина культуройБИМ В-300 Д Исходное содержание ТЭА,мг/л 1000,0 3000,0 7000,0 Пример 2. Посевной материал культурыБИМ В-301 Д выращивали в колбах Эрленмейера объемом 500 мл со 100 мл жидкой минеральной среды следующего состава (г/л)- 0,5 472 - 0,8 КН 2 РО 4 - 0,7 (4)24 - 1,5 ТЭА 0,1 рН 7,3-7,5. Культуру вносили петлей с косяков, посевной материал инкубировали на качалке, обеспечивающей 180 об./мин при 29 С в течение 168 ч. Стеклянный биореактор объемом 1 л заполняли 200 мл полученного посевного материала культурыБИМ В-301 Д и жидкой минеральной средой выше указанного состава, добавляли ТЭА до конечной концентрации 1000, 3000 и 7000 мг/л, рН доводили до 7,3-7,5. Процесс разрушения триэтиламина вели при температуре 20 С и интенсивной аэрации(36 л/ч). Эффективность разрушения ТЭА в воде определяли по остаточному содержанию токсиканта до и после очистки. Содержание ТЭА контролировали фотометрическим методом(Лурье, 1984). Результаты фотометрического анализа остаточного количества ТЭА, представленные в табл. 2, показывают, что культураБИМ В-301 Д полностью разрушает токсикант в концентрации 1000,0 3000,0 и 7000,0 мг/л за 240, 312 и 360 ч соответственно. Таблица 2 Разрушение триэтиламина культуройБИМ В-301 Д Исходное содержание ТЭА,мг/л 1000,0 3000,0 7000,0 Пример 3. Посевной материал культурБИМ В-301 Д иБИМ В-300 Д выращивали отдельно в колбах Эрленмейера объемом 500 мл со 100 мл жидкой минеральной среды следующего состава (г/л)- 0,5 472 0,8 КН 2 РО 4 - 0,7 (4)24 - 1,5 ТЭА- 0,1 рН 7,3-7,5. Культуры вносили петлей с косяков, посевной материал инкубировали на качалке, обеспечивающей 180 об./мин при 4 8474 1 2006.10.30 29 С в течение 168 ч. Стеклянный биореактор объемом 1 л заполняли 200 мл полученного посевного материала культурБИМ В-301 Д иБИМ В-300 Д и жидкой минеральной средой выше указанного состава, добавляли ТЭА до конечной концентрации 1000, 3000 и 7000 мг/л, рН доводили до 7,3-7,5. Процесс разрушения триэтиламина вели при температуре 20 С и интенсивной аэрации (36 л/ч). Эффективность разрушения ТЭА в воде определяли по остаточному содержанию токсиканта до и после очистки. Содержание ТЭА контролировали фотометрическим методом(Лурье, 1984). Результаты фотометрического анализа остаточного количества ТЭА, представленные в табл. 3, показывают, что культурыБИМ В-301 ДБИМ В-300 Д, использованные совместно для очистки воды от ТЭА в биореакторе, разрушают токсикант гораздо интенсивнее, чем каждая из использованных культур в отдельности. Так, ТЭА, содержащийся в воде в концентрации 1000,0 3000,0 и 7000,0 мг/л, разрушается культурами полностью за 96, 240 и 312 ч соответственно. Таблица 3 Разрушение триэтиламина культурамиБИМ В-301 Д иБИМ В-300 Д Исходное содержание ТЭА, мг/л 1000,0 3000,0 7000,0 Таким образом, 1000 мг/л ТЭА при совместном использовании его культурамиБИМ В-301 Д иБИМ В-300 Д разрушается на 144 ч быстрее, чем каждой из культур, использованной отдельно. Аналогичное ускорение процесса деструкции наблюдали в вариантах с 3000,0 и 7000,0 мг/л ТЭА, который смесью культур разрушался на 120 и 72 часа быстрее соответственно, чем культуройБИМ В-300 Д, а также на 72 и 48 ч быстрее соответственно, чем культуройБИМ В-301 Д. На основании проведенных исследований штаммыБИМ В 301 Д иБИМ В-300 Д при совместном применении предлагается использовать для локальной очистки сточных вод от ТЭА до поступления их в общий сток предприятия. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5