Штамм Lactococcus lactis subsp. cremoris, обладающий антибиотикорезистентностью, для получения пробиотического препарата

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Ижик Анастасия Владимировна Новик Галина Ивановна Белясова Наталья Александровна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(56) СТОЯНОВА Л.Г. и др. // Антибиотики и химиотерапия. - 2006. - Т. 51. -11-12. С. 11-17.2374320 2, 2009.88271 2, 2009.94/03195 1. КОРНИЕНКО Е.А. // Детские инфекции. - 2007. - Т. 6. -3. - С. 63-68. ШВЕЦ С.В. Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии МатериалыМеждународной научной конференции. Минск, 2008. Т. 1. - С. 129-131.(57) Штамм.БИМ В-493-Д, обладающий антибиотикорезистентностью, для получения пробиотического препарата. Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и представляет собой штамм молочнокислых бактерий, обладающий антибиотикорезистентностью, содержащий в составе клеточной стенки биологически активные липидные компоненты, перспективный для использования при производстве пробиотических препаратов и кисломолочных продуктов. В последнее время резко возрос интерес к мезофильным бактериям рода ,которые вследствие своей безвредности, высокой ферментативной и бактериоцинобразующей активности являются объектом фундаментальных исследований по созданию новых пробиотических препаратов 1-3. Основным показанием для приема пробиотиков являются различные дисбиотические состояния 4-6. Пробиотические микроорганизмы кроме таких свойств, как способность оставаться жизнеспособными при прохождении через ЖКТ (устойчивость к действию желчных кислот, соляной кислоты и панкреатических ферментов), способность к адгезии с эпителием слизистой кишечника, синтез антимикробных веществ против патогенных микроорганизмов, возможность колонизации кишечника или соответствующего органа-мишени, безопасность применения у человека,клинически доказанная польза для здоровья, должны обладать такими признаками, как 16450 1 2012.10.30 сохранение жизнеспособности при длительном хранении и устойчивость к антибиотикам,применяемым в клинической практике 7. По литературным данным лактококки чувствительны к большинству антибиотиков,используемых в клинической практике. Известны штаммы 729, -205,1605, -119 1, -112, -116, -118, -146 8, которые используются для производства пробиотических препаратов и кисломолочных продуктов. Общим недостатком перечисленных штаммов является отсутствие резистентности к антибиотикам. Наиболее близким из аналогов заявляемого изобретения является штамм.119, изолированный из простокваши 11. Недостатком данного штамма является чувствительность к представителям основных групп антибиотиков, используемых в клинической практике для лечения инфекционных заболеваний (тетрациклины,аминогликозиды, макролиды и азалиды, пенициллины, цефалоспорины и др.). Целью данного изобретения является получение нового штамма.БИМ В-493-Д, обладающего резистентностью к различным антибиотикам нового поколения. Штамм.БИМ В-493-Д был получен из.,выделенного из молока, методом адаптивной селекции по признаку множественной антибиотикорезистентности. Штамм были идентифицирован в лаборатории Коллекция микроорганизмов Института микробиологии как. , согласно определителю Берги. Селекция проводилась без использования химических и физических мутагенных факторов и генно-инженерных методов посредством длительной адаптации штамма к постепенно увеличивающимся концентрациям антибиотиков в среде культивирования. В качестве антимикробных агентов были взяты антибиотики нового поколения различной химической структуры 1. Кларитромицин (макролиды) - блокирует биосинтез белков, связываясь с 50 субъединицей рибосом. 2. Азитромицин (азалиды) - угнетает пептидтранслоказу. 3. Тримоксазол (сульфаниламиды) - блокирует синтез фолатов в клетке. 4. Ципрофлоксацин (хинолоны) - угнетает ДНК-гиразу, нарушая синтез ДНК. 5. Метронидазол (имидазолы) - ингибирует синтез нуклеиновых кислот. 6. Амоксициллин (пенициллины) - угнетает транспептидазу, вызывает лизис клетки. Для культивирования бактерий использовали среду 17 следующего состава на 1000 мл дистиллированной среды 5 г панкреатического гидролизата казеина, 5 г основного пептона, 5 г ферментативного пептона, 2,5 г дрожжевого экстракта, 20 г глюкозы, 0,25 г 472, 18 г натрийглицерофосфата, 0,5 г аскорбиновой кислоты,7,0. Бактерии выращивали при температуре 301 С в течение 18-24 часов. В результате селекции получен антибиотикорезистентный штамм молочнокислых бактерий.БИМ В-493-Д, способный к росту при высоких концентрациях антибиотиков различного действия в среде культивирования. Приобретенный признак сохранялся при поддержании штамма на питательной среде 17 ( 7,0) при длительном (более 6 месяцев) хранении. Заявляемый штамм депонирован в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов (Научная коллекция типовых и промышленно-ценных непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси) под коллекционным номером БИМ В-493-Д. Таксономическая принадлежность. Штамм был идентифицирован как.на основании совокупности морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков. 2 16450 1 2012.10.30 Культурально-морфологические признаки. На среде 17 (1 агара) формирует круглые, мелкие (диаметр 0,5-1,2 мм), бледно-кремовые, выпуклые, непрозрачные колонии с ровным краем и блестящей поверхностью. При культивировании в жидких питательных средах отмечается рост по всей толще столбика среды. Клетки штамма представляют собой грамположительные кокки, расположение в мазке одиночное, реже парное. Физиолого-биохимические признаки. Штамм разлагает глюкозу, сбраживает глюкозу и лактозу, продуцирует молочную кислоту в ходе гомоферментативного брожения. Оптимум температурного роста 301 С. Оптимум- 7,0. Пределы 4,0-7,0. Факультативный анаэроб. Максимальный титр клеток (2,5-3,21010), показатели накопления биомассы (ОП 590 1,89-1,97) и активной кислотности ( 3,40,2) регистрируются через 18-24 часа культивирования. Штамм стабилен при хранении при 4 С в питательной среде без нейтрализации в течение 60 суток. Из биомассы штамма выделен ряд липидных компонентов, обладающих биологической активностью (стимулируют активность роста пробиотических мироорганизмов). Маркерными признаками, отличающими штамм.БИМ В-493-Д от исходного штамма.и штамма-прототипа.119 являются резистентность к антибиотикам с различными механизмами действия стабильность при хранении при 4 С в питательной среде без нейтрализации в течение 60 суток биологическая активность липидных компонентов. Стабильность сохранения полезного свойства. Приобретенные признаки сохранялись при поддержании штамма на типовой питательной среде 17 ( 7,0) при длительном(более 6 месяцев) хранении (ежемесячный пересев на питательную среду 17). Штамм непатогенен, нетоксигенен. Предлагаемый штамм получен впервые и никогда ранее не использовался для получения пробиотических препаратов. Технологичность и уникальные биологические свойства заявляемого штамма иллюстрируют следующие примеры. Пример 1 Культивирование.БИМ В-493-Д. Штамм культивируют глубинно на жидкой типовой питательной среде 17 указанного выше состава ( 7,0) в течение 18-24 часов при температуре 30 С в микроаэрофильных условиях. Полученная культуральная жидкость является жидкой формой пробиотического препарата. Оптимум температуры 30 С, но штамм растет в интервале температур от 28 до 37 С. Характерно наличие роста приот 5,0 до 7,8. Возможно поверхностное культивирование штамма на агаризованной (1-2 агара) типовой среде 17. Бактерии высеваются на среду микробиологической петлей из жидкой культуры. Титр клеток.БИМ В-493-Д при глубинном культивировании - 3,11010, при поверхностном - 7,8109. Пример 2 Антибиотикорезистентность.БИМ В-493-Д. Антибиотикорезистентность исходных штаммов определяли по уровню накопления биомассы при культивировании на среде 17 (табл.). Далее производили постепенное увеличение концентрации антибиотиков в среде культивирования. В случае отсутствия или частичного ингибирования проводили постепенное увеличение концентрации препарата в среде культивирования от 2,5 до 10 мкг/мл. В случае полного ингибирования осу 3 16450 1 2012.10.30 ществляли ряд последовательных пересевов культуры (до 10) в среду с концентрацией препарата 2,5 мкг/мл с целью адаптации штамма к минимальной концентрации антибиотика, а затем начинали увеличивать концентрацию до 10 мкг/мл. Далее штаммы в течение длительного периода ежедневно пересевали в среды с максимальными концентрациями препаратов для закрепления признака антибиотикорезистентности. Характер роста бактерий в присутствии антибиотика может быть определен как ингибирование, частичное или полное подавление процесса пролиферации клеток препаратом. Резистентность исходного штамма. к различным антимикробным агентам Резистентность Концентрация,мкг/мл 24 ч 48 ч 2,5 Примечание- полное ингибирование роста культуры,- частичное ингибирование, - отсутствие ингибирования. Антибиотик Очевидно, что исходные штаммы наиболее чувствительны к кларитромицину и ципрофлоксацину, только при добавлении этих препаратов в минимальной дозе в среду культивирования наблюдалось полное ингибирование роста микроорганизмов. Наименьшая чувствительность была выявлена к тримоксазолу и метронидазолу. Азитромицин и амоксициллин оказывали частичное ингибирующее действие на рост бактериальных культур. По мере увеличения концентрации препаратов чувствительность к ним уменьшалась,однако при увеличении концентрации до 10 мкг/мл снова наблюдалось частичное ингибирование роста через 24 часа культивирования. 4 16450 1 2012.10.30 После многократных последовательных пересевов наблюдалось отсутствие ингибирования через 20-24 часа культивирования, что говорит о полной адаптации бактерий к максимальной концентрации препаратов. Пример 3 Липидные компоненты.БИМВ-493-Д. В настоящее время актуальным является получение штаммов микроорганизмов, которые не только сами являются носителями пробиотических свойств, но и являются продуцентами биологически активных субстанций, способных стимулировать рост нормальной микрофлоры кишечника. Такими субстанциями являются липиды пробиотических бактерий. Для выделения липидных компонентов.БИМ В-493-Д культивирование бактерий проводили в среде 17 в течение 24 часов при 30 С. Биомассу отмывали от компонентов среды -буфером ( 7,4) трижды путем центрифугирования культуральной жидкости при 10000 в течение 20 мин. Липидный компонент экстрагировали дважды смесью хлороформ-метанол (21, об/об) в пропорции 15 мл на 1 г сырой биомассы в течение 24 ч при 37 С при постоянном перемешивании. Объединенные экстракты липидов упаривали в вакуумном роторном испарителе при 50 С. Полученный липидный компонент (430 мг) растворили в 5 мл хлороформа и подвергли препаративной колоночной хроматографии на колонке 1 (451,8 см) с предварительно активированным (в течение ночи при 120 С) силикагелем 60 (70-230 , ). Липиды элюировали последовательно хлороформом, ацетоном и метанолом (по 400 мл соответственно),скорость элюции 3 мл/мин. Фракции (100 мл) упаривали в вакуумном роторном испарителе при 50 С. Фракции липидов были обозначены хлороформенные (- - -),содержащие неполярные липиды ацетоновые (- - -) - гликолипиды метанольные(- - -) - фосфолипиды (фиг. 1). Фракцию - (80,5 мг), содержащую гликолипиды, подвергли препаративной колоночной хроматографии на колонке 2. В качестве элюента использовали градиент метанола в хлороформе 0, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100 . Фракции (50 мл) упарили и обозначили как 2, 2, -5-2, -5-2,-10-2, -10-2, -15-2, -15-2, 20-2, 30-2, 50-2, 100-2. Главный гликолипид.В-493-Д содержится преимущественно во фракции -10-2, с увеличением концентрации метанола во фракциях преобладают фосфолипиды (фиг. 2). При анализе гликолипидов методом тонкослойной хроматографии в двух направлениях было показано, что в клетках.содержится две доминантные фракции гликолипидов (фиг. 3). Пример 4 Ростстимулирующая активность липидных компонентов.БИМ В-493-Д. Изучали активность роста трех штаммов пробиотических микроорганизмов (А -В-495-Д, Б -.В-424-Д, В -94-БИМ) в присутствии липидного компонента.БИМ В-493-Д. Липидный компонет был получен по описанной выше методике. Образцы компонента (1 мкг/50 мкл метанола) помещали в ячейки полистирольных планшетови оставляли на 4 ч при 24 С для полного испарения метанола. В качестве посевного материала были использованы физиологически активные культуры 3-й генерации. В каждую лунку было внесено по 200 мкл 17 (МРС) и по 10 мкл инокулята (5 ). Планшет был помещен в термостат (37 С) на 24 ч, по истечении которых была измерена оптическая плотность культуральной жидкости. В качестве контроля была использована культура без внесения компонента. На фиг. 4 представлены результаты изучения ростстимулирующей активности липидного компонента.БИМ В-493-Д. Показано, что макси 5 16450 1 2012.10.30 мальный эффект компоненты оказывают на культуру.(аутостимулирующая активность). Пример 5 Сохранение жизнеспособности.БИМ В-493-Д после лиофилизации и низкотемпературной консервации. Лиофилизации подвергают физиологически активную культуру.БИМ В-493-Д 3-й генерации. Штамм выращивают по примеру 1 в питательной среде 17 при 30 С в течение 20 часов. Клетки осаждают центрифугированием(10000 об/мин, 20 мин), отмывают от культуральной жидкости и ресуспедируют в криозащитной среде (2/3 от исходного объема суспензии). В качестве защитной среды используют стерильное обезжиренное молоко (10 обсухих веществ). Полученную суспензию асептически разливают по 0,2 мл в стерильные ампулы для лиофилизации при следующем режиме 1. Стадия лиофильного высушивания (5 часов) при температуре рефрижератора 55 С, глубина вакуума 810-2 . 2. Стадия удаления остаточной влаги (2,5 часа) при комнатной температуре, глубина вакуума 810-2 . 3. Отпайка ампул под вакуумом. Количество жизнеспособных клеток после лиофилизации определяют методом предельных разведений с последующим высевом в полужидкую тиогликолевую среду. Титр.БИМ В-493-Д составляет 3,9109 КОЕ/мл. Ампулы с лиофильновысушенной биомассой хранят при 4 С. Лиофильно высушенная биомасса является сухой формой пробиотического препарата. Низкотемпературной консервации подвергают физиологически активную культуру.БИМ В-493-Д 3-й генерации. Штамм выращивают по примеру 1 в питательной среде 17 при 30 С в течение 20 часов (до достижения ранней стационарной стадии роста). Клетки осаждают центрифугированием (10000 об/мин, 10 мин),отмывают от ростовой среды и ресуспедируют в криозащитной среде (2/3 от исходного объема суспензии). В качестве криозащитной среды используют стерильную питательную среду 17. Полученную суспензию асептически разливают по 1 мл в стерильные криопробирки и замораживают при -70 С. Титр клеток после низкотемпературной криоконсервации составляет 9,8109 КОЕ/мл. Как следует из примера, титр.БИМ В-493-Д после лиофилизации и низкотемпературной консервации сравним с титром физиологически активной культуры 3-й генерации (2,5-3,21010). Таким образом, впервые получен уникальный антибиотикоустойчивый штамм лактококков, обладающий по сравнению с известными аналогами выраженной антибиотикорезистентностью, стабильностью при хранении, а также рядом полезных свойств и, как следствие, возможностью применения для получения пробиотического препарата, который может быть использован для коррекции дисбиотических состояний при длительной антибиотикотерапии. Получение нового доступного штамма обеспечивает расширение ассортимента штаммов для получения пробиотических препаратов. 16450 1 2012.10.30 Источники информации 1. Стоянова Л.Г., Сульмитова Т.Д., Нетрусов А.И. Установление таксономического положения бактериоцинобразующих лактококков разного происхождения // Вестник Московского университета. Серия 16. Биология. - 2008. -4. - С. 19-26. 2. Грачева Н.М., Бондаренко В.М. Пробиотические препараты в терапии и профилактике дисбактериоза кишечника // Инфекционные болезни. - 2004. -2. - С. 53-58. 3.,,// . . . - . 117-137. 4.,,,, ,,//. - 2008.. 20. - .113 -115. 5. Соколов А.А., Митрохин С.Д., Минаев В.И., Забазный Н.П., Сергеев С.А., Широкорад В.И., Сергеев В.П., Амерханова , Афанасьев С.С., Алешкин В.А. Современные подходы к антибиотикопрофилактике госпитальных инфекций у больных, находящихся в отделениях хирургического профиля онкологического стационара // Методические указания. -24. - М., 2007.- 26 с. 6..,..//. - 2003. - . 82. - . 1-11. 7. Корниенко Е.А. Современные принципы выбора пробиотиков // Детские инфекции. 2007. -3. - С. 64 - 69. 8. Стоянова Л.Г., Егоров Н.С. Сравнительная характеристика новых штаммов. , полученных методом слияния протопластов // Микробиология. 1999. - Т. 68. -2. - С. 235-240. 9. Стоянова Л.Г., Шарма Среоши, Егоров Н.С. Вариабельность низинсинтезирующего дикого штамма.119 под действием ультрафиолетовых лучей // Антибиотики и химиотерапия. - 2006. - Т. 51,11-12. - С. 11-17. Фиг. 1. ТСХ-хроматограмма фракций, полученных при препаративной колоночной хроматографии экстракта липидов.БИМ В-493-Д на колонке 1. Примечание 1-4 - хлороформенные фракции (неполярные липиды) - - 5-8 - ацетоновые фракции (гликолипиды) - - - 9-12 - метаноловые фракции(фосфолипиды) - - - 13 - контроль (липид). Система растворителей хлороформметанолвода (65254, об/об/об) детекция - обработка 0,5 -ным раствором ванилина в этаноле с 324 Фиг. 2 Фиг. 2. ТСХ-хроматограмма фракций, полученных при препаративной колоночной хроматографии фракции - на колонке 2. Примечание 1-12 - фракции соответственно 2, 2, -5-2, -5-2,-10-2, -10-2, -15-2, -15-2, 20-2, 30-2, 50-2,100-2 13 - контроль (липид). Система растворителей хлороформметанолвода Фиг. 3. ТСХ в двух направлениях гликолипидной фракции.БИМ В-493-Д. Примечание Системы растворителей хлороформметанолвода (65254, об/об/об) длянаправления, хлороформметанолуксусная кислотавода (8012185,об/об/об) длянаправления детекция - обработка 0,5 -ным раствором орцинола в этаноле с 324 Фиг. 4. Ростстимулирующая активность липидного компонента Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 9