Штамм Lactobacillus plantarum, обладающий антибиотикорезистентностью, для получения пробиотического препарата

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ШТАММ, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ, ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Ижик Анастасия Владимировна Новик Галина Ивановна Рахуба Денис Викторович Коломиец Эмилия Ивановна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(56)2190015 1, 2002.2063436 1, 1996.2218394 2, 2003.2176668 1, 2001.5256425 , 1993. ЭЙСФЕЛЬД Д.А. Биологическая характеристика производственных штаммов лактобактерий. Автореф. дисс. Пермь, 2002. - С. 6-7, 14-16. ГОЛОД Н.А. и др. Микробиология. 2009. - Т. 78. -3. - С. 317-327.(57) ШтаммБИМ В-495-Д, обладающий антибиотикорезистентностью, для получения пробиотического препарата. Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и представляет собой штамм молочнокислых бактерий, обладающий антибиотикорезистентностью, фагоустойчивостью, содержащий в составе клеточной стенки биологически активные липидные компоненты, перспективный для использования при производстве пробиотических препаратов и кисломолочных продуктов. Бактерии родашироко используются в качестве основы пробиотических препаратов и диетических продуктов питания, предназначенных для лечения и профилактики дисбиотических состояний желудочно-кишечного тракта, стимуляции иммунной системы и нормализации обмена веществ 1, 2. Дисбиотические состояния широко распространены, имеют тяжелые последствия для здоровья, поэтому препараты для коррекции нарушенной микробиоты занимают одно из ведущих мест в комплексной терапии и профилактике заболеваний, при которых регистрируется дисбиоз 3-5. Пробиотические микроорганизмы, кроме таких свойств, как способность оставаться жизнеспособными при прохождении через ЖКТ (устойчивость к действию желчных кислот, соляной кислоты и панкреатических ферментов), способность к адгезии с эпителием слизистой кишечника,синтез антимикробных веществ против патогенных микроорганизмов, возможность колонизации кишечника или соответствующего органа-мишени, безопасность применения у 15807 1 2012.04.30 человека, клинически доказанная польза для здоровья, должны обладать такими признаками, как сохранение жизнеспособности при длительном хранении и устойчивость к антибиотикам, применяемым в клинической практике 6. Известны штаммы-114001,-14,-1,1, 2, 5, 12, которые широко используются для производства пробиотических препаратов и кисломолочных продуктов 7-9. Общим недостатком перечисленных штаммов является отсутствие резистентности к антибиотикам нового поколения. Результаты микробиологического исследования, в ходе которого проводилось изучение чувствительности пробиотиков, входящих в состав ряда молочных продуктов и лекарственных препаратов (34 штамма. и. и 21 штамм бактерий, использующихся для ферментирования молочных продуктов (закваски, показали, что пробиотические микроорганизмы чувствительны к большинству групп антимикробных препаратов 10. Наиболее близким из аналогов заявляемого изобретения является штаммиз коллекции культур микроорганизмов кафедры микробилогии биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова (прототип) 11. Штаммумеренно устойчив к эритромицину и ампициллину. Недостатком данного штамма является отсутствие резистентности к антибиотикам широкого спектра действия. Целью данного изобретения является получение нового штаммаБИМ В-495-Д, обладающего резистентностью к различным антибиотикам нового поколения. Для получения штаммаБИМ В-495-Д была проведена селекция штамма. Штамм был идентифицирован в лаборатории Коллекция микроорганизмов Института микробиологии каксогласно определителю Берги. Селекция проводилась без использования химических и физических мутагенных факторов и генно-инженерных методов посредством длительной адаптации штамма к постепенно увеличивающимся концентрациям антибиотиков в среде культивирования. Как антимикробные агенты были взяты антибиотики нового поколения различной химической структуры 1. Кларитромицин (макролиды) - блокирует биосинтез белков, связываясь с 50 субъединицей рибосом. 2. Азитромицин (азалиды) - угнетает пептидтранслоказу. 3. Тримоксазол (сульфаниламиды) - блокирует синтез фолатов в клетке. 4. Ципрофлоксацин (хинолоны) - угнетает ДНК-гиразу, нарушая синтез ДНК. 5. Метронидазол (имидазолы) - ингибирует синтез нуклеиновых кислот. 6. Амоксициллин (пенициллины) - угнетает транспептидазу, вызывает лизис клетки. Для культивирования бактерий использовали модифицированную среду МРС 12 следующего состава (г/1 л дистиллированной воды) пептон - 10, мясной экстракт - 10,дрожжевой экстракт - 5, лактоза - 10, глюкоза - 10, 24 - 2, аммоний лимоннокислый 2, натрий уксуснокислый - 5, 472 - 0,4, 452 - 0,08, -цистеин- - 0,5,твин-80 - 1, агар - 1. Бактерии выращивали при температуре 371 С в течение 18-24 часов. В результате селекции получен антибиотикорезистентный штамм молочнокислых бактерийБИМ В-495-Д, способный к росту при высоких концентрациях антибиотиков различного действия в среде культивирования. Приобретенный признак сохранялся при поддержании штамма на питательной среде МРС ( 7,0) при длительном (более 6 месяцев) хранении. Заявляемый штамм депонирован в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов (Научная коллекция типовых и промышленно ценных непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси). 2 15807 1 2012.04.30 Таксономическая принадлежность. Штамм был идентифицирован какна основании совокупности морфологических, культуральных и физиологобиохимических признаков. Культурально-морфологические признаки. При посеве в полужидкие (0,2 агара) среды штамм образует белые мелкие гладкие колонии (1-3 мм), при культивировании в жидких питательных средах отмечается рост по всей толще столбика среды. Клетки штамма представляют собой грамположительные короткие палочки, характерен племорфизм - размер клеток может значительно меняться в зависимости от возраста культуры и условий культивирования. Расположение клеток в мазке одиночное. Физиолого-биохимические признаки. Микроаэрофил. Каталазу не образует. Желатин не разжижает, нитраты не восстанавливает. Оптимальная температура роста - 371 С, оптимум- 7,00,2. Штамм ферментирует глюкозу, фруктозу, лактозу, мальтозу, целлобиозу, рибозу, галактозу без продукции газа. Глюкозу сбраживает до молочной кислоты. Максимальный титр клеток (2-3,5109), показатели накопления биомассы (ОП 590 2,1212,137) и активной кислотности ( 3,90,2) регистрируются через 16-22 часа культивирования. Штамм стабилен при хранении при 4 С в питательной среде без нейтрализации в течение 60 суток. Заявляемый штамм характеризуется устойчивостью к действию 30 фагов молочнокислых бактерий из фонда Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов. Из биомассы штамма выделен ряд липидных компонентов, обладающих биологической активностью (стимулируют активность роста пробиотических мироорганизмов, проявляют иммунологическую активность). Маркерными признаками, отличающими штаммБИМ В-495-Д от исходного штамма. и штамма-прототипа, являются резистентность к антибиотикам с различными механизмами действия стабильность при хранении при 4 С в питательной среде без нейтрализации в течение 60 суток устойчивость к фагам молочнокислых бактерий биологическая активность липидных компонентов. Стабильность сохранения полезного свойства. Приобретенные признаки сохранялись при поддержании штамма на типовой питательной среде МРС ( 7,0) при длительном(более 6 месяцев) хранении (ежемесячный пересев на питательную среду МРС). Штамм непатогенен, нетоксигенен. Предлагаемый штамм получен впервые и никогда ранее не использовался для получения пробиотических препаратов. Технологичность и уникальные биологические свойства заявляемого штамма иллюстрируют следующие примеры. Пример 1. КультивированиеВ-495-Д. Штамм культивируют глубинно на жидкой типовой питательной среде МРС с цистеином указанного выше состава ( 7,0) в течение 18-24 часов при температуре 37 С в микроаэрофильных условиях. Полученная культуральная жидкость является жидкой формой пробиотического препарата. Оптимум температуры 37 С, но штамм растет в интервале температур от 28 до 43 С. Характерно наличие роста приот 5,0 до 7,8. Возможно поверхностное культивирование штамма на агаризованной (2 агара) типовой среде МРС. Бактерии высеваются на среду микробиологической петлей из жидкой культуры. Пример 2. АнтибиотикорезистентностьВ-495-Д. Для штамма характерен умеренный рост в присутствии физиологических концентраций эритромицина и ампициллина. 3 15807 1 2012.04.30 Антибиотикорезистентность исходных штаммов определяли по уровню накопления биомассы при культивировании на среде МРС (табл. 1). Далее производили постепенное увеличение концентрации антибиотиков в среде культивирования. В случае отсутствия или частичного ингибирования проводили постепенное увеличение концентрации препарата в среде культивирования от 2,5 до 10 мкг/мл. В случае полного ингибирования осуществляли ряд последовательных пересевов культуры (до 10) в среду с концентрацией препарата 2,5 мкг/мл с целью адаптации штамма к минимальной концентрации антибиотика, а затем начинали увеличивать концентрацию до 10 мкг/мл. Далее штаммы в течение длительного периода ежедневно пересевали в среды с максимальными концентрациями препаратов для закрепления признака антибиотикорезистентности. Характер роста бактерий в присутствии антибиотика может быть определен как ингибирование, частичное или полное подавление процесса пролиферации клеток препаратом. Таблица 1 Резистентность исходного штамма. к различным антимикробным агентам Резистентность Антибиотик Концентрация, мкг/мл 24 ч 48 ч 2,5 Примечание- полное ингибирование роста культуры,- частичное ингибирование, - отсутствие ингибирования. Очевидно, что исходные штаммы наиболее чувствительны к кларитромицину и ципрофлоксацину, только при добавлении этих препаратов в минимальной дозе в среду культивирования наблюдалось полное ингибирование роста микроорганизмов. Наименьшая чувствительность была выявлена к тримоксазолу и метронидазолу. Азитромицин и 4 15807 1 2012.04.30 амоксициллин оказывали частичное ингибирующее действие на рост бактериальных культур. По мере увеличения концентрации препаратов чувствительность к ним уменьшалась,однако при увеличении концентрации до 10 мкг/мл снова наблюдалось частичное ингибирование роста через 24 часа культивирования. После многократных последовательных пересевов наблюдалось отсутствие ингибирования через 20-24 часа культивирования, что говорит о полной адаптации бактерий к максимальной концентрации препаратов. Пример 3. ФагоустойчивостьВ-495-Д. Устойчивость к бактериофагам является значимым признаком для пробиотических микроорганизмов, так как в условиях производства возможна потеря жизнеспособности бактериальной культуры вследствие контаминации фагами молочнокислых бактерий. Для проверки на фагоустойчивость бактерии культивируют при 37 С в среде МРС в течение ночи, а утром пересаживают в свежую среду МРС с добавлением 2 в концентрации 5 для получения подрощенной культуры. Далее в подрощенную культуруВ-495-Д вносят лизат фага (101) и инкубируют при 37 С. Каждые 60 мин отбирают равные аликвоты культуральной жидкости и измеряют оптическую плотность, по изменению которой судят о наличии или отсутствии лизиса бактерий фагами. В качестве контроля служат 20 штаммов молочнокислых бактерий, которые заражаются теми же штаммами бактериофагов. В табл. 2 представлены результаты, полученные при исследовании фагоустойчивости штаммаВ-495-Д. Как видно из результатов, данный штамм проявляет устойчивость ко всем фагам, использованным в данном опыте. В течение 4 часов после добавления вирусов к культуре клеток наблюдался рост оптической плотности во всех вариантах опыта, что свидетельствует об активном развитии бактериальной популяции и отсутствии фаголизиса, в то время как при добавлении данных штаммов бактериофагов к культуре контрольных клеток (в таблице -) наблюдался лизис в течение 1-4 часов. Таблица 2 ФагоустойчивостьВ-495-Д Штамм бактериофага 1 2 3 5 6 8 13 16 20 21 22 23 Пример 4. Липидные компонентыВ-495-Д. В настоящее время актуальным является получение штаммов микроорганизмов, которые не только сами являются носителями пробиотических свойств, но и являются продуцентами биологически активных субстанций, способных стимулировать рост нормальной микрофлоры кишечника. Такими субстанциями являются липиды пробиотических бактерий. Для выделения липидных компонентовВ-495-Д культивирование бактерий проводили в среде МРС в течение 24 часов при 37 С. Полученную биомассу трижды отмывали фосфатным буфером и один раз водой, после чего лиофилизировали. Экстракцию липидов проводили двумя методами с помощью органических растворителей, а также с использованием сверхкритического диоксида углерода (2) 13. При экстракции органическими растворителями к 1 г сухой биомассы добавляли 200 мл смеси растворителей хлороформ-метанол (21) и инкубировали на качалке в течение 24 часов при 37 С. Далее биомассу отделяли от растворителей центрифугированием и экстрагировали заново свежей порцией растворителей при тех же условиях. Экстракты объединяли и упаривали на роторном испарителе. Экстракцию липидов с помощью 2 проводили по описанной методике. Экстрагированный материал растворяли в хлороформе и наносили на колонку с силикагелем. Колонку элюировали порциями хлороформа, ацетона и метанола для получения фракций нейтральных, глико- и фосфолипидов соответственно. Анализ полученных фракций проводили с помощью тонкослойной хроматографии. При экстракции липидов из сухой биомассы классическим методом с помощью органических растворителей было получено 15,2 мг экстракта, содержащего нейтральные,фосфо- и гликолипиды. Данный материал в дальнейшем использовался в качестве стандарта гликолипидов. При экстракции гликолипидов из сухой биомассы с использованием сверхкритического диоксида углерода было получено 13,6 мг экстракта. Полученный липидный материал был подвергнут колоночной хроматографии с использованием силикагеля в качестве сорбента. На фиг. 1 представлен анализ фракций, полученных при элюировании колонки хлороформом, ацетоном и метанолом. Фракции 1-4, которые были получены при элюировании колонки хлороформом, содержали большую часть нейтральных липидов из исходного экстракта. Ацетоновые фракции 5-8 характеризовались большим количеством гликолипидов. Однако фракция 5 и в меньшей степени фракция 6 содержали также некоторое количество нейтральных липидов. Фракции 7 и 8 были в дальнейшем использованы для анализа гликолипидных компонентов, поскольку в них не было обнаружено фосфолипидов, которые обнаруживались в больших количествах в метанольных фракциях 9-11, а содержание нейтральных липидов было незначительным. 6 15807 1 2012.04.30 При анализе гликолипидов методом тонкослойной хроматографии было показано, что в клеткахсодержится две доминантные фракции гликолипидов(фиг. 2). Выявленные фракции имели одинаковую хроматографическую подвижность как при экстрагировании органическими растворителями, так и при использовании метода сверхкритической флюидной экстракции. Пример 5. Ростстимулирующая активность липидных компонентовВ 495-Д. Изучали активность роста трех штаммов пробиотических микроорганизмов (АВ-495-Д, Б -.В-424-Д, В 94-БИМ) в присутствии гликолипидного (1) и фосфолипидного (2) компонентовВ-495-Д. Компоненты (1 мкг/50 мкл метанола) помещали в ячейки полистирольных планшетови оставляли на 4 ч при 24 С для полного испарения метанола. В качестве посевного материала были использованы физиологически активные культуры 3-й генерации. В каждую лунку было внесено по 200 мкл МРС и по 10 мкл инокулята (5 ). Планшет был помещен в термостат (37 С) на 24 ч, по истечении которых была измерена оптическая плотность культуральной жидкости. В качестве контроля была использована культура без внесения компонента. На фиг. 3 представлены результаты изучения ростстимулирующей активности липидных компонентовВ-495-Д. Показано, что максимальный эффект компоненты оказывают на культуруВ-495-Д (аутостимулирующая активность), гликолипидный компонент оказывает значительный эффект на культуру бифидобактерий. В целом гликолипидный компонент обладает более выраженной ростстимулирующей активностью по сравнению с фосфолипидным. Пример 6. Иммунореактивность липидных компонентов-495-Д. В лунках планшета иммобилизовали липидные компоненты (1 - гликолипид, 2 фосфолипид) следующим образом компоненты добавляли из расчета 0,1 мл на лунку и оставляли при 4 С на ночь. После блокирования антигенов 0,3 раствором КСА в буфере в течение ночи при КТ промывали натрий-фосфатным буфером (100 мкл/лунка). После каждой стадии анализа лунки также промывали трижды по 0,1 мл буфером. Для определения иммунохимических свойств липидов в лунки планшетов вносили по 0,05 мл разведенных образцов сыворотки кроликов (-) и инкубировали в течение трех часов при 4 С. Для анализа использовали растворы сывороток с 100, 200, 400, 800,1600-кратным разведением, приготовленные на основе натрий-фосфатного буфера ( 7,4). В качестве контроля использовали сыворотку здорового кролика. Для выявления ,связавшихся с иммобилизованными антигенами, использовали конъюгат пероксидазы из корней хрена (ПХ) с белком(США). Раствор конъюгата (титр 1/20000) инкубировали в лунках планшета в объеме 0,05 мл в течение 1 ч при 24 С. Для инициации ферментативной реакции ПХ в лунки вносили по 0,05 мл хромогена (0,01 М тетраметилбензидин в 70 диметилсульфоксиде, разведенный 0,15 М цитрат фосфатным буфером, 5,0, содержащим 5 мМ перекись водорода, в соотношении 14), перемешивали содержимое лунок пятью-шестью круговыми движениями планшета по горизонтальной поверхности и выдерживали в течение 10-20 мин при КТ. Останавливали реакцию добавлением 0,1 мл 4,8 серной кислоты с той же скоростью и в той же последовательности, как хромоген-субстратную смесь, перемешивали содержимое лунок пятью-шестью круговыми движениями планшета по горизонтальной поверхности 14. Измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм (450) в многоканальном иммуноферментном анализаторе Витязь (Беларусь). Показано, что гликолипидный компонент обладает иммунореактивностью высокого уровня (выраженная реакция антиген-антитело начинается с 1600-кратного разведения 7 15807 1 2012.04.30 сыворотки), фосфолипидный компонент - иммунореактивностью среднего уровня (800 кратное разведение сыворотки) (фиг. 4). Следовательно, липидные компонентыВ-495-Д достаточно иммунореактивны, чтобы служить специфичекими маркерами и быть использованными в целях серологической диагностики. Пример 6. Сохранение жизнеспособностиВ-495-Д после лиофилизации и низкотемпературной консервации. Лиофилизации подвергают физиологически активную культуруБИМ В-495-Д 3-й генерации. Штамм выращивают по примеру 1 в питательной среде МРС при 37 С в течение 20 часов. Клетки осаждают центрифугированием (10000 об/мин,20 мин), отмывают от культуральной жидкости и ресуспендируют в криозащитной среде(2/3 от исходного объема суспензии). В качестве защитной среды используют стерильное обезжиренное молоко (10 об.сухих веществ). Полученную суспензию асептически разливают по 0,2 мл в стерильные ампулы для лиофилизации при следующем режиме 1. Стадия лиофильного высушивания (5 часов) при температуре рефрижератора 55 С, глубина вакуума 810-2 . 2. Стадия удаления остаточной влаги (2,5 часа) при комнатной температуре, глубина вакуума 810-2 . 3. Отпайка ампул под вакуумом. Количество жизнеспособных клеток после лиофилизации определяют методом предельных разведений с последующим высевом в полужидкую тиогликолевую среду. ТитрБИМ В-495-Д составляет 5,71010 КОЕ/мл. Ампулы с лиофильновысушенной биомассой хранят при 4 С. Лиофильно высушенная биомасса является сухой формой пробиотического препарата. Низкотемпературной консервации подвергают физиологически активную культуруБИМ В-495-Д 3-й генерации. Штамм выращивают по примеру 1 в питательной среде МРС при 37 С в течение 20 часов (до достижения ранней стационарной стадии роста). Клетки осаждают центрифугированием (10000 об/мин, 10 мин), отмывают от ростовой среды и ресуспендируют в криозащитной среде (2/3 от исходного объема суспензии). В качестве криозащитной среды используют стерильную питательную среду МРС. Полученную суспензию асептически разливают по 1 мл в стерильные криопробирки и замораживают при -70 С. Титр клеток после низкотемпературной криоконсервации составляет 3,31010 КОЕ/мл. Как следует из примера, титрБИМ В-495-Д после лиофилизации и низкотемпературной консервации сравним с титром физиологически активной культуры 3-й генерации (6,71010 КОЕ/мл). Таким образом, получен уникальный штамм, обладающий по сравнению с известными аналогами более высокой антибиотикорезистентностью, стабильностью при хранении, а также рядом полезных свойств и, как следствие, возможностью применения для получения пробиотического препарата. Получение нового доступного штамма обеспечивает расширение ассортимента штаммов для получения пробиотических препаратов. Источники информации 1. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. ТомПробиотики и функциональное питание. - М. ГРАНТЪ, 2001. - 288 с. 2..,.. .// . .. - 2004. - . 97. - . 147-156. 3.,,,, ,, 8 15807 1 2012.04.30//. - 2008.20. - . 113-115. 4. Соколов А.А., Митрохин С.Д., Минаев В.И., Забазный Н.П., Сергеев С.А., Широкорад В.И., Сергеев В.П., Амерханова А.М., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. Современные подходы к антибиотикопрофилактике госпитальных инфекций у больных, находящихся в отделениях хирургического профиля онкологического стационара // Методические указания. -24. - М., 2007. - 26 с. 5.М.,..//. - 2003. -82. - . 1-11. 6. Корниенко Е.А. Современные принципы выбора пробиотиков // Детские инфекции. - 2007. -3. - С. 64-69. 7..,.,.,.-114001//. - 2010. - . 103(1). . 58-68. 8. Гардинер Г.Е., Хайнэман К., Баройя М.Ж., Брюс Э.В., Боэрман Д., Мадренас Д.,Рейд Г. Пероральное введение комбинации пробиотиков-1 и-14 с целью использования их свойств в кишечнике человека ////////5 Дата доступа 30.03.2010. 9. Шустер , Мартьянов В.А., Ивашкина Н.Ю., Пиявский С.А., Медников Б.Л. Возможности оптимизации применения пробиотиков в клинической практике на примере отечественного препарата Аципол // Человек и лекарство. - 2009. -4. - Т. 17. -4. 250. 10. Андреева И.В. Доказательное обоснование применения пробиотиков для лечения и профилактики заболеваний ЖКТ // Медицинский совет. - 2007. -3. - С. 25-32. 11. Голод Н.А., Лойко Н.Г., Мулюкин А.Л., Нейматов А.Л., Воробьева Л.И., Сузина Н.Е., Шаненко Е.Ф., Гальченко В.Ф., Эль-Регистан Г.И. Адаптация молочнокислых бактерий к неблагоприятным для роста условиям // Микробиология. - 2009. - Т. 78. -3. С. 317-327. 12.,.,//(2)//. - 2008. - . 49. - . 45-51. 14. Цыганова А. В., Киселева Е.П., Вашкевич И.И., Прядко А.Г. Характеристика иммуноаффинной хроматографии и новый метод получения тиропероксидазы человека из субклеточных фракций щитовидной железы // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. - Т. 42. -2. - С. 236-246. Фиг. 1. ТСХ анализ липидных фракцийБИМ В-495-Д, полученных при колоночной хроматографии на силикагеле 1, 2, 3, 4 - хлороформенные фракции 5, 6,7, 8 - ацетоновые фракции, 9, 10, 11 - метаноловые фракции а) общие липиды (окраска ванилином) б) гликолипиды (окраска орцинолом) в) фосфолипиды (окраска молибденовым реагентом) 9 Фиг. 2. ТСХ анализ гликолипидовВ-495-Д (1, 2 - экстракт, полученный с помощью органических растворителей 3, 4 - очищенные гликолипидные фракции,полученные с помощью суперкритической флюидной экстракции. 1 и 2 - доминантные фракции гликолипидов) Фиг. 3 Ростостимулирующая активность липидных компонентовВ-495-Д Фиг. 4 Иммунохимическая реакция междусыворотки анти- и липидными компонентамиВ-495-Д (1 - контроль, 2 - гликолипид, 3 - фосфолипид) Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 11