Способ выделения полисахаридов из биомассы бифидобактерий

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПОЛИСАХАРИДОВ ИЗ БИОМАССЫ БИФИДОБАКТЕРИЙ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Новик Галина Ивановна Здоровенко Эвелина ЛеонтьевнаИжик Анастасия ВладимировнаСидоренко Анастасия ВячеславовнаКиселва Елена ПавловнаКнирель Юрий Александрович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(56) НОВИК Г.И. и др. // Микробиология. 2002. - Т. 71. -2. - С. 205-210... //. - 1990. - . 172. - . 2. - . 845-852.. //. - 1983. - . 755. . 3. - . 439-451. ЗАХАРОВА И.Я. и др. Методы изучения микробных полисахаридов. - Киев Наукова думка, 1982. - С. 7-30.(57) Способ выделения полисахаридов из биомассы бифидобактерий, заключающийся в том, что биомассу бифидобактерий разводят 2 -ным раствором додецилсульфата натрия до сметанообразной консистенции, обрабатывают ультразвуком 22 кГц 5 раз по 30 сек,нагревают до 100 С в течение 5 мин, отмывают дистиллированной водой от додецилсульфата натрия до 7,2, затем лиофилизируют и осуществляют экстракцию полисахаридов 10 -ным раствором трихлоруксусной кислоты в две стадии сначала при 4 С в течение 48 ч, а затем при 100 С в течение 5 мин, экстракты центрифугируют, диализируют и выделяют из них полисахариды путем проникающей гель-хроматографии. Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и медицине, в частности к изоляции биологически активных веществ из клеток пробиотических микроорганизмов, и может найти применение в области производства лечебных и лечебно-профилактических препаратов, приготовлении вакцин, производстве пищевых добавок. В настоящее время тенденции развития фармакологической отрасли требуют перехода от клеточного уровня к молекулярному, т.е. к использованию вместо клеток микроорганизмов при приготовлении фармакологических препаратов отдельных клеточных компонентов, обладающих биологической активностью. Среди подобных клеточных структур у пробиотических микроорганизмов выделяют полисахариды, обладающие биологической активностью и являющиеся перспективными для производства на их основе профилактических и лечебно-профилактических препаратов, вакцин, пищевых добавок. Настоящее изобретение относится к полисахаридам по пункту 1 формулы, выделенным из биомассы бифидобактерий. В основном полисахариды, выделенные из бифидо 16185 1 2012.08.30 бактерий, являются нейтральными полимерами, содержащими гексозы или дезоксигексозы 1. У 4011 и 101-4 изолированы и очищены гетерополисахариды, различающиеся по компонентному составу полимер, содержащий глюкозу и 6-дезокситалозу с небольшим количеством гликопептидов, и полимер, содержащий глюкозу, галактозу в пиранозной и фуранозной формах. Гетерополисахариды, имеющие в своем составе преимущественно глюкозу и галактозу, обнаружены также уи 2, 3. Для клеточной стенки 15697 характерен также синтез полисахарида, состоящего из остатков -галактопиранозы и галактофуранозы 4. Известны данные о составе полярной части липотейхоевой кислоты, связанной с клеточной стенкой. , представленной глюкозой и галактозой, отвечающей за антигенные свойства микроорганизмов рода 5. Полисахариды установленных нами структур,описанные в примерах, у бифидобактерий обнаружены впервые (фиг. 1, 2). Во втором аспекте изобретение относится к способу экстракции полисахаридов бифидобактерий и, в частности, полисахаридов по пункту 1 формулы. Известны методы изоляции полисахаридов из клеток 94 БИМ, заключающиеся в обработке бактериальной биомассы 1,5 -ным цетавлоном или 1 -ным тритоном -100 с последующим осаждением пятью объемами абсолютного этанола и обработкой нуклеазами. Очистка экстрактов проводится методом гель-фильтрации на колонке с биогелем -10 с использованием в качестве элюента 1 -ной уксусной кислоты 1. Недостатками вышеперечисленных методов являются использование большого количества абсолютного этанола, недостаточно высокий выход полисахаридов, загрязнение их продуктами деградации нуклеиновых кислот после обработки нуклеазами. Наиболее близким по достигаемому результату является метод изоляции ассоциированных с клеточной поверхностью полисахаридов 94 БИМ,заключающийся в обработке бактериальной биомассы 2 -ным додецилсульфатом натрия(при 6 С в течение 18 ч и 100 С в течение 30 мин) с последующим осаждением пятью объемами абсолютного этанола и обработкой нуклеазами. Из 32 г биомассы получают 8 мг полисахарида (0,03 от влажной биомассы). Очистка экстракта проводится методом гель-фильтрации на колонке с биогелем -10 с использованием в качестве элюента 1 -ной уксусной кислоты 1. Данный способ, однако, имеет существенные недостатки высокое (до 50 ) содержание в полимерной фракции белковых примесей, что связано с сильным связыванием додецилсульфата натрия с мембранными белками бактериальной клетки низкий выход конечного продукта (0,03 от влажной биомассы) загрязнение экстрактов полисахаридов продуктами деградации нуклеиновых кислот вследствие обработки нуклеазами использование больших объемов абсолютного этанола и генерация большого количества отходов, что делает способ экологически вредным. Задача данного изобретения заключается в разработке нового метода получения биомассы пробиотических бактерий и изоляции из нее полисахаридов, который отвечает требованиям чистоты полимерных фракций, экологичности, эргономичности, а также дает высокий выход конечного продукта. Поставленная задача решается за счет использования в качестве экстрагента 10 ного раствора (110 об.) трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Предложенный нами метод является современной альтернативой классическим методам выделения полисахаридов. Бактериальную биомассу растворяют в 2 -ном додецилсульфате натрия, затем обрабатывают ультразвуком и отмывают от додецилсульфата натрия посредством центрифугирования додистиллированной воды. Осадок используют для ступенчатой 2 16185 1 2012.08.30 экстракции полисахаридов 10 -ным раствором ТХУ, полученные экстракты диализируют, подвергают проникающей гель-хроматографии. Структуры полученных полисахаридных фракций определяют с использованием методов ГЖХ и ЯМР. Данный способ может быть использован для выделения полисахаридов из любого штамма бифидобактерий. Материалы заявки поясняются следующими графическими изображениями Фиг. 1 - Структура основного полисахарида формулы , выделенного из биомассы бифидобактерий. Фиг. 2 - Структура минорного полисахарида формулы , выделенного из биомассы бифидобактерий. Фиг. 3 - Часть двумерногоспектра ПС , где- 6)ср,- ср, - 3,6),- 3),- 2),- 3),- 3). Фиг. 4 - Часть двумерного НМВС спектра ПС . Фиг. 5 - Связываниеобразцов 1-7 сыворотки крови человека с иммобилизованной БФ-465. Для выявленияиспользованы конъюгаты пероксидазы из корней хрена с моноклональными антителами мыши противчеловека, с моноклональными антителами мыши противчеловека , с белком. Суть предлагаемого изобретения иллюстрируется приведенными ниже примерами. Пример 1 Получение биомассы бифидобактерий способом глубинного культивирования. Культурагенерации вносится (5 ) в жидкую среду МРС 6 с цистеином, глубинное культивирование осуществляется при 37 С в течение 48 часов. Затем биомассу отмывают -буфером ( 7,2) от компонентов среды четырехкратным центрифугированием(20 мин, 8000 ). Пример 2 Получение биомассы бифидобактерий способом поверхностного культивирования в станции для выращивания микроаэрофильных микроорганизмов. Культурагенерации вносится (50 ) в чашки Петри с агаризованной (2 ) средой МРС с цистеином. Чашки помещают в станцию для выращивания микроаэрофильных микроорганизмов( , Англия) и инкубируют при 37 С в смеси газов (102, 102, 802) в течение 48 часов. Бифидобактерий растут в таких условиях плотным газоном по всей поверхности среды 7. Биомассу смывают с поверхности среды -буфером ( 7,2). Данный способ получения биомассы является менее трудоемким, т.к. отсутствует необходимость отмывки биомассы от компонентов среды культивирования. Пример 3 Экстракция полисахаридов из биомассы клеток бифидобактерий с использованием 10 -ного раствора ТХУ. Биомассу бифидобактерий, полученную по примеру 1 или 2 (36 г), растворяют в 2 ном додецилсульфате натрия до сметанообразной консистенции, затем обрабатывают ультразвуком (22 кГц, 5 раз по 30 сек), нагревают до 100 С в течение 5 мин и отмывают от додецилсульфата натрия додистиллированной воды. Осадок лиофилизируют и используют для ступенчатой экстракции полисахаридов, включающей холодную (4 С, 48 ч,10 -ный раствор ТХУ) и горячую (100 С, 5 мин, 10 -ный раствор ТХУ) экстракцию. Массы ПСи ПСравны 17 и 4,2 мг соответственно (0,06 от влажной биомассы в сумме). Полученные экстракты (ПСи ПС ) центрифугируют, диализируют, лиофилизируют и подвергают очистке методом гель-проникающей хроматографии на колонке(801,6 см) с гелем -40, в качестве элюента используют 1 -ный раствор уксусной кислоты. На хроматограммах ПСи ПСприсутствует по одному полисахаридному пику, что говорит о чистоте полученных полисахаридных компонентов. 3 16185 1 2012.08.30 Пример 4 Моносахаридный анализ и метилирование полисахаридных компонентов бифидобактерий. Моносахаридный анализ проводят путем гидролиза препаратов полисахаридов (ПСи ПС ) 2 трифторуксусной кислотой (120 С, 2 ч), после упаривания гидролизата моносахариды превращают в полиолы восстановлением 4, ацетилируют 2 в пиридине и анализируют методом ГЖХ на хроматографе - 5889 (США) с капиллярной колонкой со стационарной фазой -5 в градиенте температур от 180 С до 290 С(10 град/мин). Абсолютные конфигурации моносахаридов определяют методом ГЖХ в виде ацетилированных гликозидов с -2-октанолом. Показано, что ПСсодержит глюкозу и -галактозу в соотношении 21, в то время как ПС- только -глюкозу. Метилирование полисахаридов проводят 3 в диметилсульфоксиде в присутствии твердого, метилированный ПС выделяют экстракцией этилацетатом, гидролизуют и полученные частично метилированные моносахариды превращают в ацетаты полиолов и анализируют с помощью ГЖХ, как описано выше, в градиенте температур от 150 С до 320 С (5 град/мин). Идентифицированные посредством метилирования моносахариды ПСиуказаны в табл. 1. Таблица 1 ПСПС 2,3,4,6-тетраметилглюкопираноза 2,3,4,6-тетраметилглюкоза 2,3,4-триметилгексопираноза 2,3,4-триметилглюкоза 2,4,6-триметилгексопираноза 3,4-диметилглюкоза 2,5-диметилгексофураноза 3,5,6-триметилгексофураноза Пример 5 ЯМР-спектроскопия полисахаридных компонентов, выделенных из биомассы бифидобактерий. Спектры ЯМР снимают на спектрометре 600 (Германия) в растворах 99,962 при 303 К (внутренние стандарты - ,0,0 м.д., ацетон,31,45 м.д.). Образцы предварительно лиофилизируют дважды из 2. Двумерные спектры снимали,используя стандартное программное обеспечение фирмы . Для экспериментовиспользуют длительность -17 спин-лока 200 мс. Экспериментывыполняют со временем смешивания 200 мс. -спектры замеряют с задержкой 60 мс для фиксирования дальнодействующих взаимодействий. 13 С-спектр ПСсодержит сигналы различной интенсивности. Основная серия содержит сигналы семи аномерных атомов углерода при 99,2-109,9 м.д., семи 2-групп при 61,8-70,5 м.д. и сигналы других атомов углерода моносахаридного кольца при 69,188,2 м.д. Соответственно, основная серия 1-спектра содержит сигналы семи аномерных протонов при 4,99-5,41 м.д. и других сахарных протонов в области 3,43-4,40 м.д. В табл. 2 представлены результаты 1-спектроскопии ПС , в табл. 3 - результаты 13-спектроскопии ПС . 13-спектр и 1-спектр ПСтакже содержат сигналы различной интенсивности - основная серия содержит сигналы трех -глюкопиранозных остатков. В табл. 4 представлены результаты 1- и 13-спектроскопии ПС . Для дальнейшего структурного анализа сигналы основной серии в 13-спектрах и 1 спектрах ПСи ПСбыли отнесены с помощью 1/1 , , , 1/13 гетероядерныхиэкспериментов. Отнесение сигналов вспектре ПСначинали с -1 атома каждого сахара были выявлены спиновые системы семи моносахаридных остатков, которые обозначили как , , , , ,и . Дифференциацию протонов внутри каждой спиновой системы проводили с использованием 4 16185 1 2012.08.30 спектроскопии. С помощьюэксперимента судили о связях внутри моносахаридных остатков и между ними. В табл. 5 представлены результаты -спектроскопии ПС , на фиг. 3 - часть двумерногоспектра ПС .спектр содержал следующие межзвеньевые кросс-пики -1 при 5,41 и С-3 српри 81,28,-2 при 5,12/88.15 ср-/-3 при 5,08/83,64 ср-1/ср-6 при 5,00/66,81 ср-1/-6 при 4,97/70,48. Смещение сигналов -6 остатка , -3 и -6 остатка , -2 остаткаи -3 сигналов остатков , ,в нижней области спектра по сравнению с их положением в соответствующих незамещенных моносахаридах подтверждает положение гликозилирования моносахаридов в цепи. Полученные данные соответствуют результатам метилирования ПС . Сравнение 13-ЯМР химических сдвигов с известными данными показывает, что все моносахариды связаны между собой -связями. -конфигурация всех моносахаридов подтверждается относительно низкими 1,2 константами сопряжения (3,5-4,0 Гц). Структуру ПСустанавливали аналогичным образом. В табл. 6 представлены результаты -спектроскопии ПС . На фиг. 4 представлена часть двумерного НМВС спектра ПС , на фиг. 2 - структура ПС . Установлено, что основным полисахаридом формулы , выделенным из биомассы бифидобактерий, является разветвленный глюкогалактан, построенный из гептасахаридных повторяющихся звеньев, включающих остатки альфа-глюкопиранозы, альфа-галактопиранозы и альфа-галактофуранозы. Второй выделенный полисахарид формулыпредставляет собой высокоразветвленный глюкан с основной цепью, построенной из 1,6 связанных остатков альфа-глюкопиранозы, и с боковыми единичными альфа-глюкопиранозными моносахаридными остатками, присоединенными в положение 2 глюкозного остатка основной цепи (60 ). Таблица 2 Результаты 1 Н-спектроскопии ПС(, )-6 3.99/3.76 (с) Примечание, с - сильный, ср - средний, сл - слабый Пример 6 Ростстимулирующая активность полисахаридов, выделенных из биомассы бифидобактерий. Полисахариды из биомассы бифидобактерий были выделены, как описано выше. В эксперименте были использованы физиологически активные культуры бактерий рода(.) из Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов . 6 16185 1 2012.08.30379, .94 БИМ, .791. В среду культивирования (МРС) вносили препарат полисахарида (ПС) бифидобактерий, а затем бактериальную культуру. Через 24 часа культивирования при 37 С проводили измерение оптической плотности(ОП) относительно стерильной среды культивирования при длине волны 590 нм (Фотометр КФК-3, СССР) и активной кислотности среды -(, Румыния). По результатам следили за изменением активности роста и кислотообразования бактериальной культуры в присутствии препаратов ПС бифидобактерий. В качестве контроля использовалась культурагенерации без внесения препарата. В табл. 7 представлены данные об изменениях активности роста бифидобактерий в присутствии выделенных полисахаридов. Таблица 7 Активность роста и кислотообразования бифидобактерий в присутствии полисахаридных компонентов, выделенных из биомассы бифидобактерий ОП.791 1,739 1,915 4,76 4,58 Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что полисахаридный компонент, выделенный из биомассы бифидобактерий, способен оказывать ростстимулирующее воздействие на культуры бактерий рода . Пример 7 Определение антител к компонентам бесклеточной фракции (БФ) бифидобактерий,содержащей полисахариды, в образцах сыворотки крови человека. Для получения БФ использовали культуру третьей генерации бифидобактерий из научной коллекции типовых и промышленно-ценных непатогенных микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси. Осаждали клетки центрифугированием при 5000 в течение 20 мин и промывали трижды по 30 мл 0,02 М натрий-фосфатным буфером(НФБ),7,0, содержащим 0,2 М(буфер 1), суспендируя клетки и осаждая их центрифугированием в указанных выше условиях. Клетки каждого штамма суспендировали в буфере 1, объем которого соответствовал исходному объему культуральной среды (20 мл),гомогенизировали вручную гомогенизатором (, (США в 20 мл буфера 1 и обрабатывали ультразвуком с использованием диспергатора УЗДН-2 Т (п/я В-2613, СССР) порциями по 50 мл 6 раз по 30 сек при частоте 22 кГц. Фракцию клеточных стенок осаждали центрифугированием при 31000 в течение 30 мин. БФ (супернатант) хранили при- 20 С. БФ разводили буфером 1 в 2 раза и иммобилизовали методом прямой адсорбции на полистирольных планшетах- (Германия) при 4 С в течение 12 ч из расчета 0,1 мл на лунку. После иммобилизации и каждой указанной ниже стадии анализа лунки промывали трижды по 0,2 мл буфером 1, содержащим 0,0220. Образцы сыворотки крови человека разводили в 100 раз 0,02 М натрий-фосфатным буфером,7,6, содержащим 0,15 М , 3 казеин и 0,5 фенол (буфер 2), и вносили по 0,1 мл каждого образца в 2 лунки планшета. В 2 лунки вносили по 0,1 мл буфера 2(контроль). Инкубировали 60 мин при 37 С. Во все лунки вносили по 0,1 мл конъюгата пероксидазы из корней хрена (ПХ) с белком(США) в предварительно подобранном разведении и инкубировали 60 мин при 37 С. В параллельном эксперименте использовали те же образцы сыворотки крови и конъюгаты моноклональных антител мыши противиличеловека(США). В каждую лунку вносили по 0,1 мл хромогена (0,01 М тетраметилбензидин в 70 диметилсульфоксиде, разведенный в соотношении 14 0,15 М цитрат-фосфатным буфером, 5,0, содержащим 5 мМ 22). Реакцию перекисного окисления останавливали добав 7 16185 1 2012.08.30 лением 0,1 мл 4,824 и определяли оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм (450) в многоканальном иммуноферментном анализаторе АИФ М/340 (Беларусь). Для каждого конъюгата проводили независимую обработку данных. С этой целью для каждого образца сыворотки крови рассчитывали разницу между средним значением 450 в 2 лунках планшета, содержащих данный образец, и средним значением 450 в контрольных лунках того же планшета. Результаты изучения серологической активности бесклеточной фракции бифидобактерий, содержащей полисахариды, представлены на фиг. 5. Согласно полученным данным, предлагаемый новый способ изоляции полисахаридов превосходит ранее предложенный метод с использованием ионного детергента (прототип). Преимущества предлагаемого метода заключаются в следующем 1. Чистота выделенного полисахарида позволяет определять структуры полисахаридных компонентов пробиотических бактерий. 2. Предлагаемый способ обеспечивает более высокий выход и конечного продукта(0,06 от влажной биомассы против 0,03 в прототипе). 3. Использование трихлоруксусной кислоты для экстракции полисахаридов более выгодно по сравнению с абсолютным этанолом вследствие ее невысокой стоимости, отсутствия необходимости обработки отработанных растворителей, устройства против возгорания и взрыва. 4. Выделенные полисахариды обладают высоким уровнем биологической активности. 5. Предлагаемый способ применим для масштабов промышленного производства. Источники информации 1. Новик Г.И., Астапович Н.И., Кюблер Й., Гамьян А. Характеристика полисахаридов,секретируемых 94 БИМ // Микробиология. - 2002. - Т. 71.2. - С. 205-210 (прототип). 2..,.,.,.,.// . . - 1990. - . 172. - . 2. - . 845-852. 3..,.,.,.//. . . - 1960. - 23. - . 130-135. 7. Новик Г.И., Сидоренко А.В., Рахуба Д.В., Гордиенко А.И., Вегера И.И. Исследование биосовместимости титановых сплавов медицинского назначения и микроорганизмов родав опытах// Наука и инновации. - 2009. -2. - 72. - С. 23-27. Фиг. 5 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 9