Способ криоконсервации бифидобактерий

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Сидоренко Анастасия Вячеславовна Новик Галина Ивановна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(56).., 2006.- . 72 10.- . 6474-6482. РАХУБА Д.В. и др. Микробные биотехнологии фундаментальные и прикладные аспекты Сб. научн. трудов. Т. 1.- Минск, 2007.- С. 268-275.259739 1, 1998.2005054443 1.(57) Способ криоконсервации бифидобактерий, отличающийся тем, что используют бифидобактерии стационарной стадии роста, причем бифидобактерии отделяют центрифугированием от культуральной среды, суспендируют стерильной криозащитной средой,выбранной из МРС-Ц, триптон-лактозной, пептонно-дрожжевой и тиогликолевой и взятой в равном объеме, инкубируют при 4 С в течение 30 мин, замораживают погружением в жидкий азот и хранят в жидком азоте. Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии, в частности методам хранения микроорганизмов при ультранизких температурах, и может быть использовано в пищевой промышленности, медицине, ветеринарии, научных исследованиях. Бифидобактерии как важнейшие представители нормальной микрофлоры кишечного тракта человека и теплокровных животных широко используются при производстве лечебно-профилактических препаратов и диетических продуктов питания, предназначенных для коррекции микробиоценоза кишечника, стимуляции иммунной системы и нормализации обмена веществ организма-хозяина 1, 2. Важным условием успешного использования бифидобактерий в качестве основы пробиотических препаратов и продуктов питания является сохранность исходной жизнеспособности, функциональной активности (активность роста и кислотообразования в производственных питательных средах и молоке,устойчивость к низкими антибиотикам, антагонистическая активность) и генетической стабильности культур при хранении 2, 3, 4, 5. В связи с этим значительное внимание уделяется разработке эффективных методов длительного хранения производственных и коллекционных штаммов бифидобактерий. В настоящее время для хранения пробиотических штаммов молочнокислых бактерий,в частности бифидобактерий, преимущественно используют метод лиофилизации 3, 4, 5,13747 1 2010.10.30 6. Недостатками данного метода являются трудоемкость, необходимость наличия специального оборудования, а также низкая технологичность (лиофилизированные культуры не могут быть использованы в технологическом процессе сразу после регидратации - для восстановления их функциональной активности необходимо два-три пассажа в богатых питательных средах). Кроме того, лиофилизация может приводить к возникновению в популяции молочнокислых бактерий, в частности бифидобактерий, обладающих выраженным адаптационным потенциалом, клеток с измененными, отличными от исходных характеристиками. Известны способы низкотемпературной консервации молочнокислых бактерий, в частности бифидобактерий, при -20 - -80 С 7, 8, 9. Недостатком данных методов является невозможность длительного (более нескольких месяцев) хранения культур без существенной потери клетками жизнеспособности и функциональной активности. С целью увеличения продолжительности хранения и стабилизации функциональной активности молочнокислых и бифидобактерий при низкотемпературном хранении в суспензионную среду добавляют соединения, обладающие криозащитным действием углеводы (сахароза,лактоза, трегалоза) 7, предшественники нуклеиновых кислот (азотистые основания, нуклеотиды, нуклеозиды) 8, многоатомные спирты и их эфиры (глицерол, -глицерофосфат натрия) 9. Большинство известных криопротекторов оказывает на клетки микроорганизмов токсическое действие, поэтому после отогрева криопротектор удаляют из клеточной суспензии путем последовательных отмываний и центрифугирования, культуру подращивают в богатой питательной среде, после чего используют в технологическом процессе. Таким образом, существенными недостатками низкотемпературной консервации является трудоемкость, низкая технологичность и дороговизна, связанная с приобретением коммерческих криопротекторов. Известен способ хранения микроорганизмов в жидком азоте (-196 ) - криоконсервация, который обеспечивает сохранность исходной жизнеспособности, морфологических,физиолого-биохимических и генетических свойств культур в течение длительного времени 10, 11. Существенным преимуществом данного способа перед методами, описанными выше, является практически неограниченное время хранения микроорганизмов в жизнеспособном состоянии со стабильной функциональной активностью, так как потеря жизнеспособности и функциональной активности микроорганизмов при криоконсервации происходит, главным образом, на этапах замораживания-отогрева. Известны способы криоконсервации молочнокислых бактерий, в частности бифидобактерий, в стерильном обезжиренном молоке (ОМ), а также в ОМ с добавлением криопротекторов 2-4 глутамата натрия, 10 глицерола, 0,1-5 Твина-80, 2 поливинилпирролидона, 5-10 диметилсульфоксида (ДМСО) 12, 13. Основным недостатком данных методов является низкая выживаемость и существенная потеря функциональной активности, в частности,активности кислотообразования, культур на этапах замораживания-отогрева. Наиболее близким к заявляемому способу является способ криоконсервации молочнокислых бактерий с использованием в качестве защитной среды смеси культуральной жидкости (90 ) и глицерола (10 ) (прототип) 14. Данный метод обеспечивает высокую выживаемость и сохранность функциональной активности культур в процессе замораживания и последующего хранения при ультранизких (-80 - -196 С) температурах. Недостатками названного способа являются дороговизна, связанная с приобретением коммерческого криопротектора, трудоемкость, обусловленная необходимостью концентрирования бактериальной суспензии, и низкая технологичность, обусловленная необходимостью отмывания клеток от криопротектора перед использованием в технологическом процессе. Еще одним недостатком прототипа является необходимость осуществления всех этапов подготовки бактериальной суспензии к замораживанию при 4 С, что требует наличия специального помещения, в котором поддерживается низкая температура, а также охлаждаемой центрифуги. 2 13747 1 2010.10.30 Целью изобретения является удешевление и повышение технологичности процесса криоконсервации молочнокислых бактерий, в частности бифидобактерий, при сохранении высокой жизнеспособности и функциональной активности культур на этапах замораживания-отогрева, а также последующего хранения при ультранизких температурах. Поставленная цель достигается тем, что криоконсервации подвергают культуры бифидобактерий в стационарной стадии роста, стадия концентрирования бактериальной суспензии исключается, все этапы подготовки бактериальной суспензии к замораживанию до эквилибрации клеток с криозащитной средой проводят при комнатной температуре, в качестве криозащитных сред используют стерильные питательные среды для культивирования бифидобактерий, а именно среду Де Мана с -цистеин-гидрохлоридом, триптонлактозную, пептонно-дрожжевую и тиогликолевую, без добавления криопротектора,охлаждение образцов осуществляют путем непосредственного погружения в жидкий азот. Заявляемый способ криоконсервации бифидобактерий состоит в следующем Культивирование бифидобактерий. Бактерии выращивают в жидкой среде Де Манна, Рогозы, Шарпа с добавлением 0,05-цистеин-гидрохлорида 15 (МРС-Ц) при 37 С до достижения стационарной стадии роста (20-24 часа). Подготовка бактериальной суспензии к замораживанию. Клетки бактерий осаждают центрифугированием (10000 об/мин, 10 мин), отделяют от культуральной жидкости. Клеточный осадок суспендируют в равном объеме криозащитной среды, полученную суспензию в объеме 1 мл асептически вносят в криопробирки. Все этапы приготовления бактериальной суспензии до эквилибрации клеток с криозащитной средой проводят при комнатной температуре. Для эквилибрации клеток с криозащитной средой образцы выдерживают в холодильнике ( 4 С) в течение 30 мин. Приготовление криозащитной среды. В качестве криозащитных используют стерильные питательные среды для культивирования бифидобактерий среду МРС-Ц пептон - 1,0 , мясной экстракт - 1,0 , дрожжевой экстракт - 0,5 ,глюкоза - 2,0 , аммоний лимоннокислый - 0,2 , натрий уксуснокислый - 0,5 ,24 - 0,2 , 4 - 0,02 , 4 - 0,005 , -цистеин-гидрохлорид - 0,05 , Твин 80 - 0,01 ,6,6-6,8 триптон-лактозную (ТЛ) триптон - 1,0 , дрожжевой экстракт - 0,5 , лактоза - 1,0 ,казеинат натрия - 0,1 , 24 - 0,02 , 24 - 0,02 , 4 - 0,01 ,0,01 , цитрат аммония - 0,03 , кислота аскорбиновая - 0,05 ,6,6-6,8 пептонно-дрожжевую (ПД) пептон - 2,0 , крахмал водорастворимый - 0,1 , глюкоза 1,0 , дрожжевой экстракт - 0,5 ,- 0,5 , -цистеин-гидрохлорид - 0,05 ,6,7-6,9 тиогликолевую (ТГ), производства ОАО Биомед, Россия. Замораживание бактериальной суспензии. Бактериальную суспензию замораживают путем непосредственного погружения в жидкий азот. Хранение образцов. После замораживания образцы хранят в жидком азоте при -196 С. Подготовка бактериальной культуры к использованию в технологическом процессе. Отогрев культур осуществляют на водяной бане при 37 С в течение 5 мин, после чего бактериальную суспензию используют в технологическом процессе. Заявляемый способ иллюстрируют нижеприведенные примеры его конкретного использования. Пример 1. Криоконсервация бифидобактерий. Штаммы бифидобактерий 94 БИМ, В.ГО-13,В.МС-42, В.791, В.ЛВА-3, В.379 выращивают в 3 13747 1 2010.10.30 жидкой среде МРС-Ц при 37 С до стационарной стадии роста (20-24 ч). Клетки бифидобактерий осаждают центрифугированием (10000 об/мин, 10 мин), отделяют от культуральной жидкости и суспендируют в равном объеме криозащитной среды. В качестве криозащитной среды используют стерильные питательные среды для культивирования бифидобактерий МРС-Ц, ТЛ, ПД и ТГ. Полученную суспензию в количестве 1 мл асептически вносят в стерильные криопробирки, инкубируют в холодильнике ( 4 С) в течение 30 мин, после чего замораживают путем непосредственного погружения в жидкий азот. Замороженные образцы хранят в жидком азоте при -196 С. Отогрев образцов осуществляют на водяной бане при 37 С в течение 5 мин. Пример 2. Изучение жизнеспособности бифидобактерий после замораживания и низкотемпературного хранения. Штаммы бифидобактерий 94 БИМ и 379 подвергают криоконсервации, как описано выше. Определение жизнеспособности бифидобактерий производят через 24 ч, 14 суток и 6 месяцев хранения в жидком азоте. Количество жизнеспособных клеток в образцах определяют методом предельных разведений с последующим высевом в полужидкую (0,1 агара) среду ТГ. Как видно из данных, представленных в табл. 1, количество жизнеспособных клеток бифидобактерий после криоконсервации в стерильных питательных средах МРС-Ц, ТЛ и ПД достоверно не изменялось, а после замораживания в среде ТГ незначительно снижалось. Титр клеток бифидобактерий в образцах оставался стабильным в течение 6 месяцев хранения. Таблица 1 Жизнеспособность бифидобактерий после криоконсервации в стерильных питательных средах Время хранения/КриоКоличество жизнеспособных клеток в суспензии, КОЕ/мл защитная среда контроль 24 часа 14 дней 6 месяцев 94 БИМ МРС-Ц 4,40,2108 4,30,1108 4,20,4108 4,20,3108 ТЛ 6,40,2108 5,60,2108 5,50,5108 5,80,4108 ПД 5,00,8108 4,50,5108 4,80,2108 4,30,6108 ТГ 1,50,1108 0,20,1108 0,20,1108 0,20,1108379 МРС-Ц 1,40,4108 1,20,6108 1,20,4108 1,30,3108 ТЛ 2,50,3108 2,20,3108 2,20,4108 2,10,3108 ПД 3,20,2108 3,00,5108 3,10,3108 2,90,5108 ТГ 2,20,2108 0,60,1108 0,50,2108 0,50,2108 Сравнение показателей жизнеспособности полученных при криоконсервации бифидобактерий с использованием заявляемого способа с показателями, полученными при замораживании молочнокислых бактерий с использованием метода-прототипа, показало отсутствие достоверных отличий в выживаемости криоконсервированных клеток. Пример 3. Изучение активности роста и кислотообразования криоконсервированных бифидобактерий при глубинном культивировании в питательной среде МРС-Ц. Штамм 94 БИМ подвергают криоконсервации, как описано выше. После отогрева бактериальную суспензию в количестве 1 инокулируют в полужидкую (0,1 агара) среду МРС-Ц. Культивируют при 37 С в течение 24 ч. Отбор проб для изучения динамики накопления биомассы, активности кислотообразования и количества жизнеспособных клеток осуществляют через 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 часа культивирования. 4 13747 1 2010.10.30 Из данных, представленных на фигуре, видно, что развитие интактной культуры В.94 БИМ характеризовалось непродолжительной (3 ч) лаг-фазой, максимальное накопление биомассы и количества жизнеспособных клеток происходило через 15-24 ч культивирования. После криоконсервации в средах МРС-Ц, ТЛ и ПД развитие периодической культуры В.94 БИМ характеризовалось удлинением лаг-фазы(6 ч) при максимальном накоплении биомассы и жизнеспособных клеток через 18-24 ч культивирования. Развитие популяции В.94 БИМ после замораживания в среде ТГ характеризовалось длительной (9 ч) лаг-фазой, а максимальные показатели накопления биомассы и количества жизнеспособных клеток регистрировались через 21-30 ч культивирования. Несмотря на достоверное снижение скорости роста на начальных этапах развития периодической культуры, показатели накопления биомассы и активности кислотообразования, полученные через 24 ч культивирования клеток, криоконсервированных в стерильных питательных средах, статистически значимо не отличались от величин, полученных для интактных клеток (табл. 2). Таблица 2 Показатели накопления биомассы (ОП 600) и активности кислотообразования (рН),полученные через 24 часа культивирования бифидобактерий при 37 С в среде МРС-Ц Контроль МРС-Ц ТЛ ПД ТГ Криозащитная ОП 600 ОП 600 ОП 600 ОП 600 ОП 600 среда 3,568 3,91 3,569 3,96 3,552 3,84 3,527 3,92 3,560 3,88 Пример 4. Изучение активности роста и кислотообразования криоконсервированных бифидобактерий в стерильном молоке. Штамм 94 БИМ подвергают криоконсервации, как описано выше. После отогрева бактериальную суспензию в количестве 3 инокулируют в стерильное молоко. Культивируют при 37 С в течение 24 ч. Регистрируют время, необходимое для сквашивания молока, а также показатели активной кислотности и количества жизнеспособных клеток на момент образования сгустка. Как видно из данных, представленных в табл. 3, после криоконсервации в питательных средах снижения активности роста и кислотообразования бифидобактерий в стерильном молоке не регистрировалось. Таблица 3 Влияние криоконсервации в питательных средах на развитие и сохранность 94 БИМ в молоке Количество жизнеспособных клеток при Активность развития Криозащитная в молоке хранении в молоке при 4 С среда ч КОЕ/мл 3 суток 7 суток 10 суток 8 8 8 Контроль 12 2,0110 1,21108 3,90,2 2,3210 2,4210 8 МРС-Ц 12 2,3210 1,31108 3,80,3 2,72108 2,62108 ТЛ 12 1,91108 1,01108 3,90,3 2,11108 1,91108 ПД 12 4,00,2 2,31108 2,12108 1,81108 1,01108 ТГ 24-28 4,20,2 1,5110 х 1,11108 7,32107 5,32107 Продолжительность сквашивания молока, показателии титра клеток на момент образования сгустка, полученные для бифидобактерий, криоконсервированных в средах МРС-Ц, ТЛ и ПД, не отличались от показателей, характерных для интактной культуры. После криоконсервации в среде ТГ отмечалось увеличение продолжительности сквашивания молока, однако снижения показателейи титра клеток на момент образования сгустка не наблюдалось. Изучение жизнеспособности В.94 БИМ при хране 5 13747 1 2010.10.30 нии в сквашенном молоке при 4 С показало отсутствие статистически достоверных отличий в выживаемости интактных и криоконсервированных клеток (табл. 3). Пример 5. Изучение антагонистической активности бифидобактерий после криоконсервации в стерильных питательных средах. Штамм 94 БИМ подвергают криоконсервации как описано выше. После отогрева бактериальную суспензию в количестве 1 инокулируют в питательную среду МРС-Ц. Культивируют при 37 С в течение 24 ч. Клетки бифидобактерий осаждают центрифугированием, культуральную жидкость асептически отбирают и используют для определения антагонистической активности бифидобактерий. Антагонистическую активность изучают методом лунок на агаризованной мясо-пептонной среде(МПА). В качестве тест-культур используют штаммыБИМ В-238, .БИМ В-378,. БИМ В-246,БИМ В-25,БИМ В-157,БИМ В-447. Из данных, представленных в табл. 4, видно, что после криоконсервации в питательных средах уровень антагонистической активности бифидобактерий по отношению к тестштаммам, используемым в работе, не изменился. Таблица 4 Влияние криоконсервации на антагонистическую активность 94 БИМ Криозащитная среда/Диаметр зоны задержки роста, мм Тест-культура контроль МРС-Ц ТЛ ПД ТГ.БИМ В-447 Примечание. - - отсутствие зоны подавления роста тест-культуры. Таким образом, заявляемый способ криоконсервации бифидобактерий обеспечивает сохранность исходной жизнеспособности и физиологической активности бифидобактерий и имеет ряд преимуществ перед известным способом криоконсервации бактерий (прототип) является экономически выгодным, так как нет необходимости в покупке коммерческих криопротекторов является менее трудоемким и более технологичным, так как отсутствует стадия концентрирования бактериальной суспензии, нет необходимости в отдельном приготовлении криозащитной среды, все этапы подготовки бактериальной суспензии к замораживанию до эквилибрации клеток с криозащитной средой проводят при комнатной температуре,бактериальная суспензия сразу после отогрева может быть использована в технологическом процессе активность роста и кислотообразования в питательных средах и молоке, уровень антагонистической активности криоконсервированных культур не отличается от показателей,характерных для физиологически активных культур, выращенных в богатых питательных средах. Заявляемый способ представляет интерес с практической точки зрения и может быть использован для хранения производственных культур бифидобактерий. Источники информации 1.,// . 13747 1 2010.10.30 2. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. ТомПробиотики и функциональное питание.- . Издательство ГРАНТЪ, 2001.- 288 с. 3..,.,.-., - Т.,.,Т., .,Динамика развития (а) и накопления биомассы (б)94 БИМ при глубинном культивировании в среде - после криоконсервации в разных питательных средах 1- контроль, 2 - МРС-Ц, 3 ТЛ, 4 - ПД, 5 - ТГ Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8