Способ определения меламина в молоке или молочном продукте

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕЛАМИНА В МОЛОКЕ ИЛИ МОЛОЧНОМ ПРОДУКТЕ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гигиены(72) Авторы Шуляковская Ольга Васильевна Филонов Валерий Петрович Белышева Людмила Леонидовна Полянских Елена Ильинична(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(57) Способ определения меламина в молоке или молочном продукте, включающий экстракцию меламина органическим растворителем в ультразвуковой бане, очистку и концентрирование экстракта с последующим количественным определением содержания меламина в экстракте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и расчет массовой доли меламина в молоке или молочном продукте, отличающийся тем, что экстракцию меламина проводят смесью 5 -ного раствора трихлоруксусной кислоты и ацетонитрила в течение 10 мин при температуре 50 С в ультразвуковой бане, а очистку и концентрирование экстракта осуществляют с помощью твердофазной экстракции. Изобретение относится к медицине, к разделу лабораторной диагностики, а также к пищевой промышленности. Известен способ определения меламина в молоке и молочных продуктах, основанный на экстракции меламина органическим растворителем в ультразвуковой бане с последу 15453 1 2012.02.28 ющим количественным определением содержания меламина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 1. Способ является прототипом по отношению к заявляемому. Общими признаками для заявляемого способа и прототипа являются экстракция меламина органическим растворителем в ультразвуковой бане с последующим количественным определением содержания меламина в экстракте с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Однако указанный способ не позволяет количественно определять меламин с высокой чувствительностью и точностью из-за низкой специфичности используемых растворителей. Задачей заявляемого способа является повышение чувствительности и точности определения. Поставленная задача решается следующим образом. Предложен способ определения меламина в молоке или молочном продукте, включающий экстракцию меламина органическим растворителем в ультразвуковой бане,очистку и концентрирование экстракта с последующим количественным определением содержания меламина в экстракте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и расчет массовой доли меламина в молоке или молочном продукте, причем экстракцию меламина проводят смесью 5 -ного раствора трихлоруксусной кислоты и ацетонитрила в течение 10 мин при температуре 50 С в ультразвуковой бане, а очистку и концентрирование экстракта осуществляют с помощью твердофазной экстракции. Указанные условия экстракции, очистки и концентрирования позволяют достичь максимальной чувствительности (предел обнаружения меламина увеличивается в 5 раз) и извлечения меламина из молока и молочных продуктов. Пример. Определение меламина в молоке и молочном продукте 1. Экстракция Навеску исследуемого образца 2,000,01 г помещают в пробирку для центрифугирования вместимостью 50 см 3, добавляют 5,0 см 3 5 -ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и 2 см 3 ацетонитрила. Пробирку плотно закрывают, встряхивают и помещают на 10 мин в ультразвуковую баню при температуре 50 С. Затем пробирку центрифугируют 10 мин со скоростью 4000 об/мин. Отбирают верхний слой в отдельную пробирку, а к осадку добавляют еще 5,0 см 3 5 -ного раствора ТХУ и 1,5 см 3 ацетонитрила, встряхивают, помещают в ультразвуковую баню на 10 мин, затем центрифугируют 10 мин при тех же условиях. Отбирают верхний слой и присоединяют к первой порции. К осадку в третий раз прибавляют 5 см 3 5 -ного раствора ТХУ и 1,5 см 3 ацетонитрила, встряхивают, помещают в ультразвуковую баню на 10 мин, затем центрифугируют 10 мин при тех же условиях. Отбирают верхний слой и присоединяют к первой и второй порциям. Объединенный экстракт фильтруют в мерную колбу вместимостью 25 см 3 через бумажный фильтр синяя лента, который необходимо предварительно смочить 1 см 3 5 -ного раствора ТХУ. Объем доводят до метки 5 -ным раствором ТХУ. 2. Очистка и концентрирование экстракта Для проведения твердофазной экстракции отбирают 5 см 3 экстракта, полученного по п. 1, в пробирку вместимостью 10 см 3, добавляют 5 см 3 дистиллированной воды, раствор тщательно перемешивают. При содержании жира в образце более 10 перед проведением твердофазной экстракции проводят обезжиривание экстракта (п. 1). Берут 25 см 3 экстракта, помещают в делительную воронку на 100 см 3, добавляют 25 см 3 гексана, встряхивают в течение 1 мин и оставляют до полного разделения слоев. Затем отбирают 5 см 3 нижнего слоя в пробирку для проведения твердофазной экстракции, добавляют 5 см 3 дистиллированной воды, раствор тщательно перемешивают. 15453 1 2012.02.28 Через подготовленный предварительно картридж пропускают 10 см 3 экстракта из пробирки (п. 2). Затем промывают картридж 5 см 3 дистиллированной воды, а затем 5 см 3 метанола. Высушивают картридж под вакуумом в течение 1-2 мин, а затем элюируют меламин 5 см 3 1,25 -ного раствора аммиака в метаноле со скоростью элюирования 0,51,0 см 3/мин. Полученный элюат упаривают досуха в этой же пробирке на роторном испарителе при температуре 50 С. Сухой остаток растворяют в 1 см 3 подвижной фазы, фильтруют через мембранный фильтрс размером пор 0,45 мкм.Подготовка картриджа Устанавливают картридж (3 /60 кат.5982-3236) в установку для твердофазной экстракции, включают насос, с помощью крана и секундомера устанавливают скорость элюирования метанола 0,5-1,0 см 3/мин. Через сорбент пропускают 5 см 3 метанола, а затем 6 см 3 дистиллированной воды. 3. Приготовление растворов 3.1. Приготовление 1 раствораВзвешивают (4,000,01) г , помещают в мерную колбу вместимостью 100 см 3,добавляют 50 см 3 дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения щелочи, охлаждают до комнатной температуры и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят в склянке, закрытой притертой полимерной пробкой при комнатной температуре. Раствор стабилен в течение 1 года. 3.2. Приготовление 5,0 -ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) В коническую колбу вместимостью 250 см 3 помещают (5,0000,001) г ТХУ и добавляют (95,0000,001) г дистиллированной воды, перемешивают. Раствор хранят в склянке с притертой пробкой при комнатной температуре. Раствор стабилен в течение 6 мес. 3.3. Приготовление 1,25 -ного раствора аммиака в метаноле В коническую колбу вместимостью 250 см 3 помещают (5,0000,001) г аммиака водного и добавляют (95,0000,001) г метанола, перемешивают. Раствор хранят в склянке с притертой пробкой при комнатной температуре. Раствор стабилен в течение 1 мес. 3.4. Приготовление подвижной фазы В плоскодонный стакан вместимостью 1000 см 3 помещают (2,3430,001) г октансульфоната натрия и (1,9240,001) г лимонной кислоты, растворяют в 850 см 3 дистиллированной воды, с помощью 1 растворадоводят до 3,0. Полученный раствор помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 и доводят объем дистиллированной водой до метки. К 920 см 3 полученного раствора добавляют 80 см 3 ацетонитрила. Подвижную фазу фильтруют через мембранный целлюлозный фильтр. Раствор хранят в склянке из темного стекла с завинчивающейся пробкой при комнатной температуре. Раствор стабилен в течение 1 мес. 3.5. Приготовление стандартных растворов меламина 3.5.1. Приготовление основного стандартного раствора меламина концентрацией 500 мкг/см 3 Навеску 0,10000,0001 г кристаллического меламина вносят в мерную колбу вместимостью 200 см 3, добавляют 100 см 3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 15 мин при комнатной температуре, доводят метанолом до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранят в стеклянной посуде с притертой пробкой в холодильнике. Раствор стабилен в течение 3 месяцев. 3.5.2. Приготовление стандартного раствора меламина концентрацией 100 мкг/см 3(раствор ) Отбирают 10,0 см 3 основного стандартного раствора меламина, приготовленного по п. 3.5.1, и помещают в мерную колбу вместимостью 50 см 3, объем доводят до метки подвижной фазой. Раствор хранят в стеклянной посуде с притертой пробкой в холодильнике. Раствор стабилен в течение 7 суток. 3 15453 1 2012.02.28 3.5.3. Приготовление стандартного раствора меламина концентрацией 10 мкг/см 3 (раствор Б) Отбирают 10,0 см 3 стандартного раствора меламина (раствор ), приготовленного по п. 3.5.2, и помещают в мерную колбу вместимостью 100 см 3, объем доводят до метки подвижной фазой. Раствор хранят в стеклянной посуде с притертой пробкой в холодильнике. Раствор стабилен в течение 7 суток. 3.5.4. Приготовление градуировочных растворов меламина Градуировочные растворы меламина концентрацией 0,2, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 мкг/см 3 готовят по схеме, представленной в табл. 1. Аликвотные части стандартных растворови Б меламина переносят в мерные колбы и доводят подвижной фазой до метки при 202 С. Таблица 1 Схема приготовления градуировочных растворов меламина Объем аликвотной части Концентрация меламинаградуировочОбъем мерной стандартного раствора в градуировочном ного раствора колбы, см 3 меламина, см 3 растворе, мкг/см 3 1 5,0 (раствор ) 100 5,0 2 2,5 (раствор ) 100 2,5 3 5,0 (раствор Б) 50 1,0 4 5,0 (раствор Б) 100 0,5 5 2,0 (раствор Б) 100 0,2 Градуировочные растворы хранят в стеклянной посуде с притертой пробкой в холодильнике. Растворы стабильны в течение 7 суток. 4. Установление градуировочной характеристики Полученные по п. 3.5.4 градуировочные растворы меламина хроматографируют,начиная с самой низкой концентрации. условия хроматографирования объем вводимой пробы 20 мкл скорость подачи подвижной фазы 1,5 см 3/мин температура термостата колонки 30 С длина волны 240 нм ширина оптической щели 16 нм ширина пика 0,1 мин 4 нм. Каждый градуировочный раствор хроматографируют не менее 2 раз, принимая за результат измерения среднее арифметическое параллельных измерений. 5. Построение градуировочного графика Для построения градуировочного графика устанавливают зависимость площади пиков от соответствующей концентрации меламина в градуировочном растворе. Прямая градуировочного графика должна проходить через начало координат и определяться функциональной зависимостью,(1) где- площадь пика меламина- концентрация меламина в градуировочном растворе- коэффициент регрессии. Градуировочный график рассчитывается методом наименьших квадратов. 6. Выполнение измерений Анализ полученного по п. 2 фильтрата проводят на жидкостном хроматографе. Условия хроматографирования такие же, как и при построении градуировочного графика п. 4. Определяют площади пиков, используя компьютерную систему обработки сигналов. Проводят анализ двух параллельных проб. 4 15453 1 2012.02.28 7. Обработка результатов измерений Расчет содержания меламина , мг/кг, проводят по формуле 13,(2)2 где- концентрация меламина, найденная по градуировочному графику, мкг/см 3- масса навески, г 1 - общий объем экстракта, 25 см 3 2 - объем экстракта, взятого для пропускания через картридж, 5 см 3 3 - объем подвижной фазы, взятый для растворения сухого остатка пробы после упаривания, 1 см 3. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений. Вычисления проводят до третьего знака после запятой и округляют до второго. Результаты определения меламина в молоке и молочных продуктах представлены в табл. 2. Таблица 2 Определяемое содержания меламина в молоке и молочных продуктах предлагаемым способом Наимено- Температу- Время Внес. Определяе- Извле- Предел Смесь раствора экстрак- экстрак- к-во, мое кол-во,вание че- обнаруже- рителей для продукта ции, мин мг/кг мг/кг ние,ния, мг/кг экстракции ции, С По предлагаемому способу 5 4,31 86,25 40 10 4,41 88,1 15 4,51 90,2 5 4,54 90,7 5 ТХУМолоко 50 10 5 4,94 98,8 0,2 ацет-л 52 15 4,85 97,6 5 4,76 95,2 60 10 4,84 96,9 15 4,89 97,9 5 4,16 83,2 40 10 4,23 84,9 15 4,25 84,7 5 4,51 90,2 5 ТХУТворог 50 10 5 4,74 95,0 0,2 ацет-л 52 15 4,75 94,7 5 4,72 94,4 60 10 4,75 95,0 15 4,75 95,0 2 ТХУ 4,86 97,3 ацет-л 16 5 ТХУМолоко 50 10 5 4,94 98,8 0,2 ацет-л 52 10 ТХУ 4,89 97,9 ацет-л 34 5 ТХУСливки 50 10 5 4,97 99,4 0,2 ацет-л 52 Известный способ (прототип) 50 трифторуксусная Молоко Комнатная 15 5 4,0 80,1 1,0 кислота 5 15453 1 2012.02.28 Достигаемый технический результат заявляемого способа заключается в том, что способ позволяет в 5 раз увеличить предел обнаружения (увеличение чувствительности метода), а также повышает точность определения на 3,1-18,7 . Источники информации 1. МУК 4.1.2420-08. Методические указания по определению меламина в молоке и молочных продуктах. - М., 2008 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6