Способ определения левомицетина в молоке

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕВОМИЦЕТИНА В МОЛОКЕ(71) Заявитель Учреждение образования Могилевский государственный университет продовольствия(72) Авторы Шуляк Татьяна Леонидовна Коротченко Наталья Федоровна(73) Патентообладатель Учреждение образования Могилевский государственный университет продовольствия(56) Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и определению остаточных количеств левомицетина в продуктах животного происхождения. Минск-Москва, 1991. Инструкция 4.1.10-15-59-2005. Определение левомицетина в продуктах животного происхождения. - Минск, 2005. ГОСТ Р 51600-2000. Молоко. Методы определения антибиотиков.0285792 1, 1988.2026693 , 1980.2180748 1, 2002.. /. - 1990. - . 38.2. - . 427-429.2005/010168.1702302 1, 1991.(57) Способ определения левомицетина в молоке, включающий отбор пробы, восстановление левомицетина до аминопроизводного добавлением соляной кислоты, диазотирование аминопроизводного левомицетина и оценку окраски пробы, отличающийся тем, что пробу молока отбирают объемом 2-5 мл, восстановление левомицетина до аминопроизводного проводят концентрированной соляной кислотой объемом 0,6-1,2 мл в присутствии цинковой пыли в количестве 0,02-0,04 г, смесь выдерживают 5 мин при комнатной температуре и затем 5 мин на водяной бане при температуре 58-62 С, диазотирование аминопроизводного левомицетина проводят 10 -ным раствором нитрита натрия в смеси с концентрированной соляной кислотой в соотношении 1001 объемом 0,3-0,7 мл, после чего смесь встряхивают и выдерживают в течение 1-2 мин, затем фильтруют через двухслойный марлевый фильтр, в полученный фильтрат добавляют -нафтол в виде 2 -ного раствора в 40 -ном растворе гидроокиси натрия в количестве 1-2 капель, смесь тщательно перемешивают и при появлении красной окраски через 30-60 с делают вывод о наличии левомицетина в молоке. Изобретение относится к молочной промышленности и может быть использовано для контроля сырого молока на наличие антибиотика левомицетина. Известен способ определения левомицетина в молоке, включающий отбор пробы и подготовку ее к анализу, восстановление левомицетина до аминопроизводного добавлением соляной кислоты, диазотирование аминопроизводного левомицетина и оценку окраски 11240 1 2008.10.30 пробы. Подготовку пробы к анализу осуществляют путем экстракции левомицетина органическим растворителем, далее пробу концентрируют выпариванием, полученный экстракт подвергают хроматографическому разделению, идентифицируют и ориентировочно оценивают концентрацию левомицетина в экстракте. Восстановление левомицетина в пробе осуществляют 10 -ным раствором соляной кислоты. Диазотирование проводят продувкой азота. Окрашивание достигают путем взаимодействия пробы с -диметиламинобензальдегидом. Появление желтых пятен на хроматографической пластине свидетельствует о наличии левомицетина в пробе. Недостатками известного способа являются длительность и трудоемкость. Для реализации способа необходимо сложное и дорогостоящее оборудование, особо чистые реактивы и стандарты, наличие высококвалифицированного персонала. Данный метод не может использоваться для повседневного контроля молока на молочных заводах. Задачей настоящего изобретения является упрощение способа, обеспечение его экспрессности. Технический результат достигается тем, что в способе определения левомицетина в молоке пробу молока отбирают объемом 2-5 мл, восстановление левомицетина до аминопроизводного проводят концентрированной соляной кислотой объемом 0,6-1,2 мл в присутствии цинковой пыли в количестве 0,02-0,04 г, смесь выдерживают 5 мин при комнатной температуре и затем 5 мин на водяной бане при температуре 58-62 С, диазотирование аминопроизводного левомицетина проводят 10 -ным раствором нитрита натрия в смеси с концентрированной соляной кислотой в соотношении 1001 объемом 0,3-0,7 мл, после чего смесь встряхивают и выдерживают в течение 1-2 мин, затем фильтруют через двухслойный марлевый фильтр, в полученный фильтрат добавляют -нафтол в виде 2 -ного раствора в 40 -ном растворе гидроокиси натрия в количестве 1-2 капель, смесь тщательно перемешивают и при появлении красной окраски через 30-60 с делают вывод о наличии левомицетина в молоке. Молоко представляет собой сложную многокомпонентную систему, в которой содержатся вещества, способные реагировать с используемыми реактивами аналогично левомицетину. Прежде всего, это относится к белкам, содержащимся в молоке в значительных количествах (2,7-3,3 ) и имеющим в своей структуре аминогруппы 2 и ароматические бензольные ядра подобно аминопроизводному левомицетина. Поэтому без исключения влияния белков на протекание химической реакции на левомицетин и без использования определенных приемов реализации способа невозможно обнаружение микроколичеств левомицетина в молоке. Согласно предлагаемому способу пробу молока отбирают объемом 2-5 мл. Так как молоко является жидкостью, то более простым и целесообразным способом отбора пробы является отбор по объему, а не по массе. В предлагаемом способе соляная кислота используется не только для восстановления левомицетина до аминопроизводного, но и для коагуляции основного белка молока - казеина. Выпадение казеина в осадок резко снижает его реакционную способность, что позволяет исключить влияние белка на ход протекания реакции на левомицетин. Для коагуляции казеина и полного восстановления левомицетина, содержащегося в 2-5 мл молока, необходимо 0,6-1,2 мл концентрированной соляной кислоты. Использование кислоты в концентрированном виде позволяет в минимальной степени разбавлять пробу молока и тем самым повысить чувствительность способа. Согласно химизму способа 2 2 азокраситель красного цвета , соляная кислота необходима также и на стадии диазотирования аминопроизводного левомицетина нитритом натрия. В предлагаемом способе невозможно использовать соляную кислоту в избытке один раз на стадии восстановления левомицетина, так как казеин, выпавший в осадок, начинает повторно растворяться, что в конечном итоге отрицательно влияет на ход протекания реакции на левомицетин (появляется красное окрашивание пробы молока, не содержащего левомицетин). Поэтому соляная кислота применяется дважды на стадии восстановления левомицетина и на стадии диазотирования. Результаты хорошо воспроизводятся при использовании для диазотирования аминопроизводного левомицетина смеси 10 -ного раствора нитрита натрия с концентрированной соляной кислотой в соотношении 1001 объемом 0,3-0,7 мл. Использование 10 -ного раствора нитрита натрия без соляной кислоты не позволяет получать стабильной красной окраски при наличии левомицетина в молоке. Для прохождения любой химической реакции необходим определенный промежуток времени. Для реакции восстановления микроколичеств левомицетина, содержащегося в 2-5 мл молока, до аминопроизводного необходимо 10 мин, причем в течение первых 5 мин реакция протекает при комнатной температуре, а затем 5 мин при нагревании на водяной бане. В течение первых 5 мин хватает собственной теплоты реакции на восстановление левомицетина до аминопроизводного. Дальнейшее протекание реакции обеспечивается за счет внешнего подвода тепла от водяной бани, причем температура водяной бани должна составлять 58-62 С. Указанная температура водяной бани обеспечивает интенсивное протекание реакции восстановления левомицетина и исключает денатурацию сывороточных белков молока при нагревании. Как известно, при температуре 63 С и выше происходит денатурация сывороточных белков молока, при этом ранее скрытые группы сывороточных белков (в частности, аминогруппы 2) высвобождаются, их реакционная способность возрастает, и они могут вступать в реакцию с используемыми реактивами аналогично левомицетину, вызывая появление красного окрашивания пробы молока, не содержащего левомицетин. Для обеспечения полного протекания реакции диазотирования аминопроизводного левомицетина во времени и получения наиболее стабильных результатов необходима выдержка пробы молока после добавления смеси 10 -ного нитрита натрия с концентрированной соляной кислотой в соотношении 1001 в течение 1-2 мин. Такая выдержка позволяет получать хорошо воспроизводимые результаты и не растягивать анализ во времени. 11240 1 2008.10.30 В предлагаемом способе необходимым приемом является фильтрование пробы через двухслойный марлевый фильтр, что позволяет отделить осадок белка и повысить яркость получаемой окраски. Для образования азокрасителя красного цвета взаимодействие диазосоединения с -нафтолом должно происходить в щелочной среде. Наиболее яркое красное окрашивание пробы наблюдается при использовании 2 -ного раствора -нафтола в 40 -ном растворе гидроокиси натрия в количестве 1-2 капель. Использование 40 -ного раствора щелочи позволяет создать щелочную среду при минимальном использовании реактива (1-2 капли), что в свою очередь повышает чувствительность способа, так как проба практически не разбавляется. Окраску пробы молока необходимо оценивать через 30-60 с после добавления 2 -ного раствора -нафтола в 40 -ном растворе гидроокиси натрия. Эта выдержка является достаточной, чтобы реакция образования азокрасителя прошла полностью, и наблюдалось стабильное красное окрашивание. Способ определения левомицетина в молоке осуществляется следующим образом. В чистую пробирку отбирают 2-5 мл исследуемого молока, добавляют пипеткой 0,6-1,2 мл концентрированной соляной кислоты и цинковую пыль в количестве 0,02-0,04 г. Содержимое пробирки тщательно встряхивают, выдерживают в течение 5 мин при комнатной температуре и в течение 5 мин на водяной бане при температуре 58-62 С. После этого в пробирку добавляют 0,3-0,7 мл смеси 10 -ного раствора нитрита натрия с концентрированной соляной кислотой в соотношении 1001, встряхивают и выдерживают в течение 1-2 мин. Содержимое пробирки фильтруют через двухслойный марлевый фильтр,в полученный фильтрат добавляют 1-2 капли 2 -ного раствора -нафтола в 40 -ном растворе гидроокиси натрия, тщательно перемешивают. При появлении красной окраски через 30-60 с делают вывод о наличии левомицетина в молоке. Пример 1 В молоко, отсутствие левомицетина в котором подтверждено стандартизированным в Республике Беларусь хроматографическим методом, добавляют левомицетин в концентрации 1,5 мкг/г. В чистую пробирку отбирают 2 мл исследуемого молока. К молоку добавляют пипеткой 0,6 мл концентрированной соляной кислоты и цинковую пыль в количестве 0,02 г. Содержимое пробирки тщательно встряхивают, выдерживают в течение 5 мин при комнатной температуре и в течение 5 мин на водяной бане при температуре 58 С. После этого в пробирку добавляют 0,3 мл смеси 10 -ного раствора нитрита натрия с соляной кислотой в соотношении 1001, встряхивают и выдерживают в течение 1 мин. Содержимое пробирки фильтруют через двухслойный марлевый фильтр, в полученный фильтрат добавляют 1 каплю 2 -ного раствора -нафтола в 40 -ном растворе гидроокиси натрия, тщательно перемешивают. Через 30 с оценивают окраску содержимого пробирки. Содержимое пробирки имеет красное окрашивание. Пример 2 В чистую пробирку отбирают 5 мл молока, отсутствие левомицетина в котором подтверждено стандартизированным в Республике Беларусь хроматографическим методом. К молоку добавляют пипеткой 1,2 мл концентрированной соляной кислоты и цинковую пыль в количестве 0,04 г. Содержимое пробирки тщательно встряхивают, выдерживают в течение 5 мин при комнатной температуре и в течение 5 мин на водяной бане при температуре 62 С. После этого в пробирку добавляют 0,7 мл смеси 10 -ного раствора нитрита натрия с соляной кислотой в соотношении 1001, встряхивают и выдерживают в течение 2 мин. Содержимое пробирки фильтруют через двухслойный марлевый фильтр, в полученный фильтрат добавляют 2 капли 2 -ного раствора -нафтола в 40 -ном растворе гидроокиси натрия, тщательно перемешивают. Через 60 с оценивают окраску содержимого пробирки. Содержимое пробирки имеет желтое окрашивание. 4 11240 1 2008.10.30 Пример 3 В молоко, отсутствие левомицетина в котором подтверждено стандартизированным в Республике Беларусь хроматографическим методом, добавляют левомицетин в концентрации 1,4 мкг/г. В чистую пробирку отбирают 3,5 мл исследуемого молока, добавляют пипеткой 0,9 мл концентрированной соляной кислоты и цинковую пыль в количестве 0,03 г. Содержимое пробирки тщательно встряхивают, выдерживают в течение 5 мин при комнатной температуре и в течение 5 мин на водяной бане при температуре 60 С. После этого в пробирку добавляют 0,5 мл смеси 10 -ного раствора нитрита натрия с соляной кислотой в соотношении 1001, встряхивают и выдерживают в течение 1,5 мин. Содержимое пробирки фильтруют через двухслойный марлевый фильтр, в полученный фильтрат добавляют 1 каплю 2 -ного раствора -нафтола в 40 -ном растворе гидроокиси натрия,тщательно перемешивают. Через 45 с оценивают окраску содержимого пробирки. Содержимое пробирки имеет желтое окрашивание. Таким образом, красный цвет свидетельствует о присутствии левомицетина в молоке в концентрации 1,5 мкг/г и выше. Желтый цвет свидетельствует об отсутствии левомицетина в молоке или его концентрации в молоке ниже 1,5 мкг/г. Для реализации предлагаемого способа содержание левомицетина в молоке не должно быть менее 1,5 мкг/г. Данное количество левомицетина является той минимальной концентрацией, которую удается обнаружить качественно по красной окраске. Предлагаемый способ позволяет обнаруживать микроколичества левомицетина в молоке на основе качественной реакции на левомицетин за счет использования определенных приемов выполнения способа с обязательным соблюдением всех условий его реализации. Использовать пробу молока объемом менее 2 мл нецелесообразно, так как это приводит к уменьшению количества всех применяемых реактивов, и после фильтрования пробы объем фильтрата оказывается настолько незначительным, что затрудняется оценка получаемой окраски. Использование пробы объемом свыше 5 мл нецелесообразно из-за неоправданного перерасхода сырья и реактивов. Использование цинковой пыли в количестве менее 0,02 г приводит к получению кремово-желтой окраски, что свидетельствует о том, что этого количества недостаточно для полного восстановления микроколичеств левомицетина, содержащегося в 2-5 мл молока. Увеличение количества цинковой пыли выше 0,04 г приводит к появлению нехарактерного черно-серого оттенка пробы, что затрудняет конечную оценку получаемой окраски. Применение соляной кислоты на стадии восстановления левомицетина объемом менее 0,6 мл не вызывает полной коагуляции казеина, что может привести к появлению красной окраски в молоке, не содержащем левомицетин. При использовании концентрированной соляной кислоты объемом более 1,2 мл происходит повторное растворение казеина, что также отрицательно влияет на достоверность получаемых результатов. При выдержке пробы после добавления соляной кислоты и цинковой пыли менее 10 мин не удается достичь постоянно воспроизводимой красной окраски. По-видимому,этого времени не всегда бывает достаточно, чтобы до конца прошла реакция восстановления микроколичеств левомицетина, содержащегося в молоке. Выдерживать пробу молока свыше 10 мин нецелесообразно, так как при этом увеличивается продолжительность способа в целом. К неоправданному расходу энергии приводит также выдержка пробы в течение 10 мин при нагревании, так как экспериментальным путем установлено, что хорошо воспроизводимые результаты наблюдаются при выдерживании пробы первых 5 мин при комнатной температуре. Выдержка пробы при комнатной температуре свыше 5 мин приводит к приостановке реакции, что не позволяет при наличии левомицетина в молоке стабильно получать красную окраску пробы. При температуре водяной бани ниже 58 С не удается получить хорошо воспроизводимых результатов, так как при таком нагревании реакция восстановления левомицетина до аминопроизводного происходит недостаточно 5 11240 1 2008.10.30 интенсивно. При температуре свыше 62 С наблюдается красное окрашивание пробы молока, не содержащего левомицетин, что может свидетельствовать о влиянии на ход протекания реакции денатурированных при нагревании сывороточных белков молока. Использование смеси 10 -ного раствора нитрита натрия с соляной кислотой в соотношении 1001 объемом менее 0,3 мл не дает стабильной красной окраски при наличии микроколичеств левомицетина в молоке, что свидетельствует о том, что используемых реактивов недостаточно, чтобы реакция диазотирования прошла полностью. Использование смеси объемом свыше 0,7 мл нецелесообразно, так как разбавляется исследуемая проба и чувствительность способа снижается. При выдержке пробы после добавления смеси 10 -ного нитрита натрия с концентрированной соляной кислотой в соотношении 1001 менее 1 мин не обеспечивается полного протекания реакции диазотирования аминопроизводного левомицетина во времени и получения стабильных результатов. Выдержка свыше 2 мин увеличивает продолжительность способа и снижает его экспрессность. При выдержке пробы после добавления 2 -ного раствора -нафтола в 40 -ном растворе гидроокиси натрия менее 30 с не наблюдается воспроизводимости результатов, так как этого времени недостаточно, чтобы реакция образования азокрасителя прошла полностью. При выдержке пробы свыше 60 с окраска может измениться (от красной до темнобурой или зеленой), что может быть вызвано разрушением азокрасителя и взаимодействием различных соединений молока с используемыми реактивами. Таким образом, предлагаемый способ открывает принципиально новые возможности обнаружения малых доз антибиотика левомицетина в молоке. Способ прост в исполнении,не предъявляет особых требований к квалификации персонала, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, имеет хорошую воспроизводимость результатов, сравнительно высокую чувствительность и обладает всеми признаками экспрессности, то есть осуществляется в течение 15-17 мин, что в 35 раз быстрее по сравнению с используемым в настоящее время в Республике Беларусь способом-прототипом, продолжительность которого составляет не менее 10 ч. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6