Способ получения регенеранта сортовой голубики высокой Vaccinium corymbosum L. с повышенным содержанием антоциановых пигментов

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕГЕНЕРАНТА СОРТОВОЙ ГОЛУБИКИ ВЫСОКОЙ. С ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ АНТОЦИАНОВЫХ ПИГМЕНТОВ(71) Заявители Учреждение образования Полесский государственный университет Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Кудряшова Оксана Александровна Волотович Антон Анатольевич Герасимович Татьяна Васильевна Беда Ирина Олеговна Хрипач Владимир Александрович(73) Патентообладатели Учреждение образования Полесский государственный университет Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(56) СИДОРОВИЧ Е.А. и др. Клональное микроразмножение новых плодовоягодных растений. - Минск Навукатэхнка, 1996. - С. 120-125.1533 1, 1996.1824115 1, 1993.881 1, 1995.(57) Способ получения регенеранта сортовой голубики высокой. с повышенным содержанием антоциановых пигментов, заключающийся в том, что эксплант, состоящий из двух метамеров, высаживают на питательную среду с 4,8-5,0 следующего состава, мг/л среды аммоний азотнокислый 400,00 калий сернокислый 990,00 магний сернокислый семиводный 370,00 калий фосфорнокислый однозамещенный 170,00 кальций азотнокислый 400,00 кальция хлорид 82,80 марганец сернокислый одноводный 16,90 цинк сернокислый семиводный 8,60 медь сернокислая пятиводная 0,25 борная кислота 6,20 натрий молибденовокислый двухводный 0,25 железосернокислое семиводное 27,80 трилон Б 37,30 тиамина хлорид 1,00 пиридоксина хлорид 0,50 никотиновая кислота 0,50 глицин 2,00 18521 1 2014.08.30 мезоинозитол 100,00 аденина сульфат 80,00 5,00 6-(,-диметилаллиламино)пурин индолилуксусная кислота 1,00 24-эпибрассинолид 0,25-0,75 сахароза 30000,00 агар-агар 8000,00 вода деионизированная остальное,инкубируют в течение 8 недель при освещенности 6000 лк/м 2, фотопериоде 16 ч день, 8 ч ночь, температуре 25 С и относительной влажности воздуха 70 . Изобретение относится к сфере биотехнологии, к области клеточных технологий в растениеводстве, к направлению клонального микроразмножения растений. Область применения изобретения биотехнология, сельское и лесное хозяйство, пищевая и медицинская промышленность. Согласно прототипу 1-3 клональное микроразмножение регенерантов сортовой голубики высокой.осуществляется на питательной, агаризованной среде 4, 5, содержащей в своем составе аммоний азотнокислый, калий сернокислый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций азотнокислый, кальция хлорид, марганец сернокислый, цинк сернокислый, медь сернокислую, борную кислоту, натрий молибденовокислый, железосернокислое, трилон Б,тиамина хлорид, пиридоксина хлорид, никотиновую кислоту, глицин, мезоинозитол, аденина сульфат, 6-(,-диметилаллиламино)пурин, индолилуксусную кислоту, сахарозу,агар-агар. Задача изобретения заключается в модификации состава питательной, агаризованной среды для получениярегенерантов сортовой голубики высокой с существенно повышенным содержанием антоциановых пигментов, широко используемых в пищевой промышленности. Задача решается тем, что в процессе приготовления питательной агаризованной среды используются высокие концентрации (0,25-0,75 мг/л) 24-эпибрассинолида, и высадка размножаемыхэксплантов сортовой голубики высокой осуществляется на модифицированную питательную, агаризованную среду, содержащую аммоний азотнокислый,калий сернокислый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный,кальций азотнокислый, кальция хлорид, марганец сернокислый, цинк сернокислый, медь сернокислую, борную кислоту, натрий молибденовокислый, железосернокислое, трилон Б, тиамина хлорид, пиридоксина хлорид, никотиновую кислоту, глицин, мезоинозитол, аденина сульфат, 6-(,-диметилаллиламино)пурин, индолилуксусную кислоту,сахарозу, агар-агар, дополненную 24-эпибрассинолидом, при следующем соотношении компонентов в мг/л аммоний азотнокислый 400,00 калий сернокислый 990,00 магний сернокислый семиводный 370,00 калий фосфорнокислый однозамещенный 170,00 кальций азотнокислый 400,00 кальция хлорид 82,80 марганец сернокислый одноводный 16,90 цинк сернокислый семиводный 8,60 медь сернокислая пятиводная 0,25 борная кислота 6,20 2 18521 1 2014.08.30 натрий молибденовокислый двухводный 0,25 железосернокислое семиводное 27,80 трилон Б 37,30 тиамин хлорида 1,00 пиридоксин хлорида 0,50 никотиновая кислота 0,50 глицин 2,00 мезоинозитол 100,00 аденина сульфата 80,00 5,00 6-(,-диметилаллиламино)пурин индолилуксусную кислоту 1,00 24-эпибрассинолид 0,25-0,75 сахароза 30000,00 агар-агар 8000,00 вода деионизированная остальное. Кислотность питательной среды 4,8-5,0. После посадки экспланты инкубируют в течение 8 недель при освещенности 6000 лк/м 2,фотопериоде 16 ч день, 8 ч ночь, температуре 25 С и относительной влажности воздуха 70 . Модифицированная нами питательная, агаризованная среда позволяет достоверно при 0,01 и прямо пропорционально концентрации 24-эпибрассинолида увеличить содержание в регенерантах собственно антоцианов в 1,72-2,44 раза, лейкоантоцианов в 1,43-1,50 раза,суммы антоциановых пигментов - в 1,48-1,59 раза. Пример 1. Исследования проводили на базе биотехнологической лаборатории НИЛ клеточных технологий в растениеводстве УО Полесский государственный университет. В качестве объекта исследований использовали размножаемыерегенеранты позднеспелого сортаголубики высокой .. в количестве не менее 80 регенерантов для каждого варианта опыта в четырехкратной повторности. Регенеранты получали в результате культивирования эксплантов (состоящих из двух метамеров) в колбах конических (объемом по 100 мл) с 25 мл стерильной агаризованной,питательной среды на микро-, макро-солевой основе 4, 5, содержащей 5,00 мг/л 6-(,-диметилаллиламино)пурина и 1,00 мг/л индолилуксусной кислоты, из расчета 20 эксплантов/колбу. Варианты опыта различались по содержанию 24-эпибрассинолида в составе агаризованной, питательной среды, содержащей в мг/л аммоний азотнокислый 400,00 калий сернокислый 990,00 магний сернокислый семиводный 370,00 калий фосфорнокислый однозамещенный 170,00 кальций азотнокислый 400,00 кальция хлорид 82,80 марганец сернокислый одноводный 16,90 цинк сернокислый семиводный 8,60 медь сернокислую пятиводную 0,25 борную кислоту 6,20 натрий молибденовокислый двухводный 0,25 железосернокислое семиводное 27,80 трилон Б 37,30 тиамин хлорида 1,00 пиридоксин хлорида 0,50 никотиновая кислота 0,50 3 18521 1 2014.08.30 глицин 2,00 мезоинозитол 100,00 аденина сульфата 80,00 5,00 6-(,-диметилаллиламино)пурин индолилуксусную кислоту 1,00 24-эпибрассинолид 0,25-0,75 сахароза 30000,00 агар-агар 8000,00 вода деионизированная остальное. Кислотность питательной среды 4,8-5,0. Через 8 недель культивирования на стеллажах световой установки культурального помещения биотехнологической лаборатории при температуре 25 С, фотопериоде день), относительной влажности воздуха 70 анализировали содержание собственно антоцианов 6, лейкоантоцианов и суммы антоциановых пигментов 7 в регенерантах. Содержание лейкоантоцианов рассчитывали как разницу между суммарным содержанием антоциановых пигментов и содержанием собственно антоцианов. Единица измерения собственно антоцианов, лейкоантоцианов и суммы антоциановых пигментов - мг , т.е. количество мг антоциановых пигментов в 100 г сырой массы регенеранта. Общий математический анализ данных проводили по стандартным методам вариационной статистики 8 с использованием программы статистического анализа данных 6.0. Результаты исследований сведены в табл. 1. Таблица 1 Изменчивость параметров накопления антоциановых пигментов у регенерантов сортаголубики высокойВариант опыта СА, мгЛА, мгСАП, мг 25,00 ИУК 1,00 (кон 312,8009,735 2935,41793,251 3248,217102,758 троль) 25,00 ИУК 1,00 ЭБ 0,25 536,90019,950 4295,450174,169 4832,350189,797 25,00 ИУК 1,00 ЭБ 0,25 620,40026,534 4203,15082,885 4823,550109,414 25,00 ИУК 0,50 ЭБ 0,75 763,66738,319 4392,25092,670 5155,917130,966 НСР 0,05 62,831 214,454 243,778 НСР 0,01 83,781 285,961 325,063 Примечание НСР - наименьшая существенная разница при 0,05 и 0,01 соответственно фитогормоны 2 - 6-(,-диметилаллиламино)пурин ЭБ - 24-эпибрассинолид ИУК индолилуксусная кислота- достоверно отличается от контроля при Р 0,01. Пример 2. Исследования проводили на базе биотехнологической лаборатории НИЛ клеточных технологий в растениеводстве УО Полесский государственный университет. В качестве объекта исследований использовали размножаемыерегенераты позднеспелого сортаголубики высокой .. в количестве не менее 80 регенерантов для каждого варианта опыта в четырехкратной повторности. Регенеранты получали в результате культивирования эксплантов (состоящих из двух метамеров) в колбах конических (объемом по 100 мл) с 25 мл стерильной агаризованной,питательной среды на микро-, макро- солевой основе 4, 5 (без 6-(,диметилаллиламино)пурина и индолилуксусной кислоты), из расчета 20 эксплан 4 18521 1 2014.08.30 тов/колбу. Варианты опыта различались по содержанию 24-эпибрассинолида в составе агаризованной, питательной среды, содержащей в мг/л аммоний азотнокислый 400,00 калий сернокислый 990,00 магний сернокислый семиводный 370,00 калий фосфорнокислый однозамещенный 170,00 кальций азотнокислый 400,00 кальция хлорид 82,80 марганец сернокислый одноводный 16,90 цинк сернокислый семиводный 8,60 медь сернокислую пятиводную 0,25 борную кислоту 6,20 натрий молибденовокислый двухводный 0,25 железосернокислое семиводное 27,80 трилон Б 37,30 тиамин хлорида 1,00 пиридоксин хлорида 0,50 никотиновая кислота 0,50 глицин 2,00 мезоинозитол 100,00 аденина сульфата 80,00 24-эпибрассинолид 0,25-0,75 сахароза 30000,00 агар-агар 8000,00 вода деионизированная остальное. Кислотность питательной среды 4,8-5,0. Через 8 недель культивирования на стеллажах световой установки культурального помещения биотехнологической лаборатории при температуре 25 С, фотопериоде день / ночь - 16 ч/8 ч, освещенности 6000 лк/м 2 (4 люминесцентных лампы 36/76 ), относительной влажности воздуха 70 , анализировали содержание собственно антоцианов 6, лейкоантоцианов и суммы антоциановых пигментов 7 в регенерантах. Содержание лейкоантоцианов рассчитывали как разницу между суммарным содержанием антоциановых пигментов и содержанием собственно антоцианов. Единица измерения собственно антоцианов, лейкоантоцианов и суммы антоциановых пигментов - мг , т.е. количество мг антоциановых пигментов в 100 г сырой массы регенеранта. Общий математический анализ данных проводили по стандартным методам вариационной статистики 8, с использованием программы статистического анализа данных 6.0. Результаты исследований сведены в табл. 2. Сравнительный анализ результатов исследований, представленных в табл. 1 и 2, позволяет установить эффект синергизма 6-(,-диметилаллиламино)пурина, индолилуксусной кислоты и 24-эпибрассинолида применительно к накоплению собственно антоцианов в регенерантах. В отсутствии 6-(,-диметилаллиламино)пурина и индолилуксусной кислоты, при повышении концентрации 24-эпибрассинолида у регенерантов снижалось содержание собственно антоцианов, но достоверно при 0,01, существенно увеличивалось содержание лейкоантоцианов (табл. 2), в связи с чем показатели суммы антоциановых пигментов также существенно возрастали, прямо пропорционально повышению концентрации 24-эпибрассинолида в составе питательной, агаризованной среды (табл. 2). 18521 1 2014.08.30 Таблица 2 Изменчивость параметров накопления антоциановых пигментов у регенерантов сортаголубики высокойВариант опыта СА, мгЛА, мгСАП, мг(контроль) 254,7336,463 3069,567110,874 3324,3001 14,900 ЭБ 0,25 208,36710,616 3663,76789,462 3872,06799,493 ЭБ 0,50 241,6178,647 3743,05079,811 3984,66787,984 ЭБ 0,75 183,6675,605 3833,383100,907 4017,05097,218 НСР 0,05 62,831 214,454 243,778 НСР 0,01 83,781 285,961 325,063 Примечание НСР - наименьшая существенная разница при 0,05 и 0,01 соответственно- тип питательной среды (микро- и макро- солевая основа)- достоверно отличается от контроля при 0,05- достоверно отличается от контроля при 0,01. Источники информации 1. Сидорович Е.А., Кутас Е.Н. Клональное микроразмножение новых плодовоягодных растений. - Минск Навукатэхнка, 1996. - С. 121-124 (прототип). 2.1533 С 1, 1996. 3.1824115 А 1, 1993. 4.,. - /,., 1999-2000. - 454 . 5. Решетников В.Н. и др. Некоторые аспекты микрокловального размножения голубики высокой и брусники обыкновенной // Плодоводство. - 2007. - Т. 19. - С. 209-216. 6. Шнайдман Л.О., Афанасьева В.С. Методика определения антоциановых веществ. Рефераты и доклады сообщений.Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. - М., 1965. - С. 79-80. 7..,.. 1.// . .. - 1959. - . 10. - . 1. - . 63-68. 8. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. - М. Агропромиздат, 1985. - 351 с. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6