Способ получения генетически трансформированных растений с повышенным содержанием крахмала, рекомбинантная двухцепочечная ДНК- молекула

(а) введение в геном клетки растения рекомбинантной двухцепочечной ДНК-молекулы, состоящей из(1) промотора, действие которого в растениях вызывает продуцирование РНК-последовательности в целевых тканях растения(11) структурной ДНК-последовательности, вызывающей продуцирование РНК-последовательности, которая кодирует слитый полипептид, включающий амино-концевой пластидный транзитный пептид и фермент АДФтлюкозо-пирофосфорилазу(111) Т-нетранслируемой ДНК-области, действие которой в клетках растения вызывает терминацию транскрипции И присоединение полиаденилированных нуклеотидов к 3-концу РНКпоследовательности(Ь) продуцирование трансформированных клеток растения И(с) регенерацию из трансформированных клеток растения генетически трансформированных растений с повышенным содержанием крахмала.2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанным в нем растением является картофель.3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанным в нем растением является томат.4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фермент АДФ-глюкозо-пирофосфорилаза разрегулирован с понижением аллостерической регуляции при сохранении адекватной каталитической активности.5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанным в нем растением является картофель.6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанным в нем растением является томат.7. Способ по п. 4, отличающийся тем, что источником структурной ДНК-последовательности являются бактерии.8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что указанным в нем растением является картофель.9. Способ по п. 7, отличающийся тем, что указанным в нем растением является томат.10. Способ по п. 4, отличающийся тем, что источником структурной ДНК-последовательности являются растения или водоросли.(1) промотор, действие которого в растениях вызывает продуцирование РНК-последовательности в целевых тканях растения(11) структурная ДНК-последовательность, вызывающая продуцирование РНК-последовательности, которая кодирует слитый полипептид, включающий амино-концевой пластидный транзитный пептид и фермент АДФ-глюкозо-пирофосфорилазу(111) 3-нетранслируемая ДНК-область, действие которой в клетках растения вызывает терминацию транскрипции и присоединение полиаденилированных нуклеотидов к 3-концу РНКпоследовательности, причем указанный промотор является гетерологичным по отношению к структурной ДНК.12. ДНК-молекула по п. 11, отличающаяся тем, что фермент АДФ-глюкозо-пирофосфорилаза разрегулирован с понижением аллостерической регуляции при сохранении адекватной каталитической активности.13. ДНК-молекула по п. 11, отличающаяся тем, что промотор является гетерологичным по отношению к источнику структурной ДНК АДФ-глюкозо-пирофосфорилазы.14. ДНК-молекула по п. 11, отличающаяся тем, что источником структурной ДНК последовательности являются бактерии.18. ДНК-молекула по п. 11, отличающаяся тем, что малая субъединица АДФ-глюкозопирофосфорилазы является малой субъединицей АДФтлюкозо-пирофосфорилазы картофеля и имеет последовательность (ЗЕО 113 11 о 7).Изобретение относится к области генной инженерии, в частности к способам получения генетически трансформированных растений.Настоящее описание служит отчасти продолжением заявки на патент США с серийньш М 07/539763, поданной 18 июня 1990 г. под заглавием Повышенное содержание крахмала в растения.Последнее достижения в области генной инженерии создают предпосылки для получения растений, имеющих в своем составе инородные гены. Теперь можно выводить сорта с уникальными с тотпси зрения агрономии, сбора и переработки урожая характеристиками. Одним из наиболее желательных признаков является, разумеется,повьппенное содержание и качество крахмала в различных сельскохозяйственных культурах.Крахмал представляет собой полисахарид, который исходно образован молекулами глюкозы, соединенными между собой альфа-1-4 и альфа-1-6 связями. Он присутствует в растительных клетках в форме нерастворимых в воде зерен или гранул. Образующийся в процессе фотосинтеза крахмал локализуется и хранится в хлоропластах. Кроме того,крахмал синтезируется в корнях и таких резервных органах, как клубни и семена. В этих тканях, где фотосинстез отсутствует, крахмал находится в пластидах, называемых амилопластами. Также как в хлоропластах, крахмал амилопластов сохраняется в форме гранул. Размер последних варьирует в зависимости от вида растений.Фактически крахмал состоит из амилозы и амилопектина двух разных типов полимеров глюкозы. Амилоза образована, в основном, линейньпии цепями из молекул глюкозы, связанных алЬфа 1-4 связями. Длина амилозной цепи составляет в среднем 1000глюкозы связаны альфа-1-6 связями. Средняя длинатаких цепей равна примерно 20-25до последнего времени не существовало единого мнения относительно роли АДФглюкозы и УДФ-гпюкозы в качестве субстратов биосинтеза крахмала. После выделения мутантных форм Агаыдорзйз у которых отсутствует АДФ-глюкозопирофосфорилаза,общепризнанно, что в качестве субстрата биосинтеза крахмала растения используют АДФ-глюкозу. Все биосинтетические реакции этого процесса происходят в хлоропластах или амилопластах. Различают три стадии биосинтеза крахмала. На первой стадии из глюкозо-1-фосфата и АТФ под воздействием АДФ-глюкозопирофосфорилазы (ЕС 2.7.7.27) образуется АДФ-глюкоза. На втором этапе АДФ-глюкоза используется синтазой крахмала ( ЕС 24.1.21) для формирования линейных цепей крахмала, содержащих альфа 1-4 связи. На третьей стадии ферменты, разветвляюшие прямую цепь (ЕС 2.4.1.18), вводят альфа-1-6 связь, что приводит к формированию молекулы амилопектина.Лимитирующая стадия биосинтеза крахмала в растениях остается предметом разногласий. Предполагают, что такой стадией служит образование АДФ-гшокозы при участии АДФ-глюкозопирофосфорилазы, однако доказательства в пользу такого предположения отсутствуют. В опубликованной заявке на Европейский патент Кв 0368506 А 2 которая касается АДФ-глюкозопирофосфорилазы, ставится под сомнением роль этого фермента в качестве ключевого фактора биосинтеза крахмала. Аргумент, опровергающий возможность контролирующего воздействия АДФ-гшокозопирофосфорилазы в процессе биосинтеза крахмала, можно почерпнуть из результатов исследований с мутантньпи штаммом Агаыаорзйэ (Ып, 1988 а, в ). Установлено, что этот мутант ( ТЬ 46 ) содержит только приблизительно 5 АДФ-глюкозопирофосфорилазной активности,обнаруживаемой в диких штаммах. Тем не менее, мутантные растения все же продуцируют крахмал в количестве около 40 его общего биосинтеза в диких разновидностях. Если АДФ-глюкозопирофосфорипаза действительно является лимитирующим процесс ферментом, то придется принять, что снижение ферментативной активности на 95 должно приводить к более чем 60 ному уменьшению накопления крахмала. Сходным образом, определение экстрагируемой активности в опытах ин витро позволяет сделать вывод, что указанный фермент может лимитировать скорость реакции лишь в том случае,если его активность ин виво значительно понижена аллостерическими регуляторами ферментативной активности.Задачей изобретения является повьппение содержания крахмала в растениях.Предложен способ получения генетически трансформированных растений с повышенным содержанием крахмала, при котором осуществляют следующие стадии(а) введение в геном клетки растения рекомбинантной двухцепочечной ДНК ВУ 4142 С 1(1) промотора действие которого в растениях вызывает продуцирование РНК ПОСЛСДОВЗТСЛЬНОСТИ В ЦСЛСВЬШ тканях растения(11) структурной ДНК-последовательности, вызывающей продуцирование РНКпоследовательности, которая кодирует слитый полипептид включающий амино-концевой пластиднь 1 й транзитный пептид и фермент АДФ-глюкозо-пирофосфорилазу(111) Зднетранслируемой ДНК-области, действие которой в клетках растения вызывает терминацию транскрипции и присоединение полиаденилированных нуклеотидов к 3- концу РНК-последовательности(Ь) продуцирование трансформированных клеток растения и(с) регенерацию из трансформированных клеток растения генетически трансформированных растений с повышенным содержанием крахмала.В частности, растением является картофель или томат.В предпочтительном варианте фермент АДФ-глюкозо-пирофосфорилаза разрегулирован с понижением аллостерической регуляции при сохранении адекватнойВ одном варианте источником структурной ДНК-последовательности являютсяВ другом варианте источником структурной ДНК-последовательности являются растения или водоросли.Другим объектом изобретения является рекомбинантная двухцепочечная ДНКмолекула, включающая последовательности в следующем порядке(1) промотор, действие которого в растениях вызывает продуцирование РНК последовательности в целевых тканях растения(11) структурная ДНК-последовательность, вызывающая продуцирование РНКпоследовательности, которая кодирует влитый полипептид, включающий амино-концевой пластидный транзитный пептид и фермент АДФ-глюкозо-пирофосфорилазу(111) Зднегранслируемая ДНК-область, действие которой в клетках растения вызывает терминацию транскрипции и присоединение полиаденилированных нуклеотидов к 3- концу РНК-последовательности, причем указанный промотор является гегерологичньтм по отношению к структурной ДНК.В одном из вариантов фермент АДФ-глюкозо-пирофосфорилаза разрегулирован с понижением аллостерической регуляции при сохранении адекватной каталитической