Способ получения обогащенных каталитических фракций поликлональных антител

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОБОГАЩЕННЫХ КАТАЛИТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ(71) Заявитель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(72) Автор Генералов Игорь Иванович(73) Патентообладатель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(57) Способ обогащения каталитической фракции поликлональных антител, включающий исходную очистку препарата иммуноглобулина аффинной хроматографией на протеине А или , отличающийся тем, что фракции, содержащие наиболее высокие концентрации антител, объединяют, дополнительно хроматографируют на подходящей ионообменной матрице, определяют каталитическую активность полученных фракций и фракции, проявляющие максимальную активность, объединяют. Изобретение относится к иммунологии, медицине, биотехнологии и может быть использовано для получения обогащенных препаратов поликлональных каталитических антител . В настоящее время каталитические антитела (абзимы) начинают широко применяться в химии и биотехнологии для синтеза биологически активных соединений, а также в медицине для диагностики, профилактики и лечения заболеваний 2. Чаще для этого используются моноклональные каталитические , хотя широкое внедрение в практику моноклональных абзимов во многом сдерживается их высокой стоимостью. Наиболее часто моноклональный антительный катализ используют для реакций, которые невозможно (в природе нет соответствующих катализаторов), трудно или дорого проводить иным способом. Либо это асимметрический (хиральный) синтез 6, 8 с выходом одной формы рацемата с 95 -99 чистотой (это особенно важно для синтеза антибиотиков и других лекарственных препаратов), либо катализ реакций с получением весьма дорогостоящих продуктов (биологически активных пептидов, гормонов и других биорегуляторов). Получение поликлональных каталитических антител представляет собой гораздо более дешевый вариант абзимного катализа с более высоким количественным выходом абзимов. Оказалось, что поликлональные абзимы закономерно возникают в ходе иммунного ответа и могут быть выделены из сывороток с сохранением каталитической активности. Наиболее существенным препятствием в использовании поликлональных абзимов является их гетерогенность. Лишь небольшая часть (в лучшем случае - несколько процентов 10522 1 2008.04.30 5) специфическихпроявляют каталитическую активность. Тем самым суммарная каталитическая активность препаратаоказывается невысокой. Основным способом обогащения каталитических поликлональныхявляется аффинная хроматография препарата поликлонального абзима на гаптене-субстрате (или аналоге субстрата), которым производилась иммунизация 4. Этот способ, однако, обладает рядом существенных недостатков. В частности, для каждой абзимной реакции необходим отдельный синтез аффинной матрицы с гаптеном для очистки соответствующих каталитических . При этом всегда существует вероятность разрушения аффинной матрицы каталитическим антителом, которое подвергается очистке. Наконец, наличие в препарате помимо катализирующих, еще и связывающих субстрат ИГ, приводит к значительным трудностям при выделении абзимных фракций. В целом, по мнению ряда авторов до сих пор не существует удовлетворительного способа выделения каталитически активных фракций из общего пула поликлональных ИГ 3, 4. Прототипом заявляемого способа является существующий в настоящее время метод выделения каталитических фракций поликлональныххроматографией на аффинной матрице с привитым субстратом или гаптене-стабильном аналоге субстрата реакции, катализируемой поликлональными абзимами 7. В качестве модельной реакции в прототипе использовалась реакция гидролиза поликлональными кроличьими антителами 4,4,4 триметокситритильного эфира. В кислотно-основном механизме катализа данной реакции основную роль играет комплементарность зарядов активных центров антител с положительно заряженным переходным комплексом субстрата. Каталитические антитела были получены после иммунизации кроликов бромидомтрис(4-метоксифенил)-(6-карбоксигексил)-фосфония-стабильным аналогом субстрата катализируемой реакции. Метод включает несколько стадий получение очищенного препарата поликлональных , обладающих каталитической активностью, из сывороток крови методом аффинной хроматографии на протеинеили А синтез аффинной матрицы для обогащения антител на основе конъюгации субстрата реакции триметокситритил хлорида с эпоксиактивированной сефарозой 4 В хроматографию исходного препарата каталитическихна матрице с привитым субстратом в некаталитических условиях элюцию связавшихся обогащенных каталитических фракцийв условиях гидролиза адсорбированными антителами привитого к матрице субстрата диализ фракций с последующей ультрафильтрацией для концентрирования полученных препаратов каталитических. Метод прототипа обладает следующими недостатками длительность выделения фракций - весь процесс хроматографии на матрице объемом 1 мл занимал 12 ч, причем для максимального выхода адсорбированных фракцийокончательная скорость элюции была минимальной (0,01 мл/мин) невозможность повторного использования аффинной матрицы, так как адсорбированные абзимы необратимо разрушали привитый к матрице субстрат в ходе хроматографии высокое (до 50 ) неспецифическое связываниев некаталитических условиях вследствие гидрофобных взаимодействий. С учетом вышеуказанных недостатков прототипа, в заявляемом способе предлагается использовать для обогащения фракций поликлональных каталитическихметод ионообменной хроматографии. Фракционирование на ионообменниках базируется на разнице в зарядах между матрицей и разделяемыми компонентами смеси. В частности,такой подход наиболее применим для обогащения абзимных фракций, катализирующих реакции, основанные на комплементарности зарядов между субстратом и активным центром абзима. 2 10522 1 2008.04.30 Задачей изобретения является упрощение и удешевление метода обогащения поликлональных абзимов с возможностью многократного использования ионообменной матрицы, а также уменьшение времени очистки, что снижает денатурацию абзимных фракций. Сущность изобретения заключается в том, что после получения очищенного каталитической препарата поликлонального иммуноглобулина аффинной хроматографией на протеине А илипроводят его дальнейшую хроматографию на ионообменной матрице,определяют абзимную активность полученных фракций и далее отбирают пробы, проявляющие максимальную каталитическую активность. Способ осуществляется следующим образом материалом для исходного получения препаратов поликлональных каталитических антител служат сыворотки больных аутоиммунными заболеваниями, в частности ревматоидным артритом и системной красной волчанкой (СКВ). На первом этапе очисткуиз сывороток проводят по методам, изложенным в Невинский, 1. Для получения сыворотки негепаринизированную человеческую кровь в количестве 3-5 мл инкубируют в течение 2 ч при температуре 4 С до образования сгустка. Затем центрифугируют 10-15 мин в центрифужных пробирках в центрифуге с бакетным ротором (1500 об/мин). Аккуратно забирают сыворотку. Иммуноглобулины высаливают из сывороток в течение 2 ч при 4 С раствором сульфата аммония 40 насыщения. Далее проводят аффинную хроматографию, пропуская препарат через колонку с агарозой, конъюгированной с протеином А золотистого стафилококка, уравновешенную 0,1 М фосфатным буфером со скоростью 6-7 капель в минуту. Колонку последовательно промывают 0,1 М фосфатным буфером рН 7,4 с 1 раствором тритона Х-305, а затем без детергента в количестве 5-6 объемов колонки до исчезновения белка в элюенте. Элюцию связавшихся иммуноглобулинов класса(1,2,4) ведут 0,1 М глицин-НС буфером рН 2,8 до исчезновения белка в элюенте (отбирают отдельно фракции по 1,5-2 мл). Пробы немедленно нейтрализуют раствором Трис-НС, рН 8,0. Концентрацию белка в элюатах определяют методом Бредфорд. Фракции, содержащие наиболее высокие концентрации иммуноглобулинов, объединяют и диализуют. Концентрацию белка в очищенных препаратахоценивают спектрофотометрией при 280 нм. Контроль чистоты полученных ИГ проводят иммуноэлектрофорезом, электрофорезом в градиентном 4-20 полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях с окрашиванием Кумасси 250 или нитратом серебра. По результатам этих исследований примесей неиммуноглобулиновой природы в очищенном препаратене обнаруживается. Микробиологический контроль препаратовосуществляли при помощи посева полученного препаратана кровяной агар и среду Сабуро. После инкубации в течение 5 суток при 37 С роста колоний обнаружено не было. Далее было подтверждено, что часть выделенных препаратовобладает собственной абзимной ДНКазной активностью, вызывая гидролиз ДНК тимуса теленка. Для проведения ДНКазной реакции к 0,1 мл раствора ДНК в концентрации 0,81,0 мг/мл добавляют 0,1 мл фракции ИГ, 0,1 мл 0,02 М трис- буфера рН 7,4 с 0,05 М 2 и 0,1 мл 0,15 М . В контроле вместо иммуноглобулинов используют 0,15 М. После инкубации в течение 20 часов при 37 С на поверхность проб наслаивают 20 мкл 0,75 раствора риванола, встряхивают и оценивают реакцию турбидиметрическим способом. Для этого по 0,2 мл каждого образца помещают в планшет для ИФА и фотометрируют на мультискане АИФ М/340 (пр-ва ПО Витязь, Республика Беларусь) при длине волны 620 нм. 3 10522 1 2008.04.30 С учетом роли комплементарности зарядов в ДНКазной реакции для обогащения каталитически активных фракцийна следующем этапе используют метод ионообменной хроматографии. До проведения хроматографии препаратыхранят в пробирках для микропроб при-18 С. Ионообменную хроматографию проводят на колонках объемом по 8 мл, заполненных-акрилексом А-50 (в фосфатной форме). Матрица уравновешивается 0,01 М ФБР,рН 6,0. Иммуноглобулины в количестве 1,3 мг нагружают на сорбент. После входа препаратав колонку проводят инкубации препаратас матрицей в течение 1 часа. Начальную элюцию проводят тем же буфером (0,01 М ФБР, рН 6,0) со скоростью 0,5 мл/мин. Дальнейшую элюцию проводят ступенчатым градиентом хлорида натрия (0,51,0-2,0 М растворна 0,01 М ФБР, рН 6,0). Концентрацию белка в пробах после хроматографии измеряют по методу Бредфорд. Собирают элюаты объемом 1 мл каждый. В полученных элюатах проводят определение ДНКазной активности по вышеуказанному способу. Результаты эксперимента представлены на фигуре А и В. Фракционирование абзимов с ДНКазной активностью при хроматографии на акрилексе А-50.. Абзимная активность фракций свободного объема.. ДНКазная абзимная активность минорной фракции , элюированной 0,5 М раствором . 4 10522 1 2008.04.30 Из них следует, что данный препаратсодержит не менее двух фракций ИГ, обладающих ДНКазной абзимной активностью. Выходящая в свободном объеме фракцияс основными свойствами (более 90 от общей белковой нагрузки на колонку), сохраняла около 25 исходной ДНКазной активности. В свою очередь после элюции 0,5 М растворомоказывается, что на матрице сорбировалось всего до 8 от общего количества нагруженных , которые обладали кислыми свойствами в условиях хроматографии при рН 6,0. При этом связанная с сорбентом минорная фракциясохраняет до 75 от исходной суммарной ДНКазной активности абзима (см. рис. 1 В). Дальнейшее повышение концентрациине привело к появлению дополнительных белковых фракций в элюатах. После пересчета активности на концентрацию ИГ в пробах выявляется, что с помощью ионообменной хроматографии удается достигнуть не менее чем 25-30-кратного обогащения каталитических ДНКазных(величина подсчитана суммарно для элюатов 4, 5,6, 7). Для проб 5 и 6, взятых изолированно, этот показатель еще выше (см. табл.). Хроматография , обладающих ДНКазной активностью,на анионообменной матрице -акрилекс А-50 фракции 3 4 5 6 7 Количество белка в пробе,39 980 96 38 25 Фракции мкг свободного объема ДНКазная ак(мл) тивность ( от 0 22,41,92,40 суммарной в препарате)фракции 4 5 6 7 Количество белка в пробе,38 23 33 14 Фракции после мкг элюции 0,5 МДНКазная ак(мл) тивность ( от 18,222,826,26,1 суммарной в препарате) 200 549 749 В вышеуказанных условиях весь процесс хроматографии не превышает 2-х часов. Положительный эффект изобретения. Предлагаемый нами способ ускоряет, упрощает и существенно удешевляет обогащение каталитических фракций поликлональных антител. Заявляемый метод не требует приготовления аффинной матрицы с гаптеном или субстратом, необходимой для последующего выделения обогащенного абзимного препарата, ионообменную матрицу после регенерации можно использовать многократно, время проведения хроматографии сокращается до 2 часов, хроматография проводится в мягких условиях, что уменьшает денатурацию каталитических антител. Источники информации 1. Невинский. 2.,//. . . - 2001. - . 1. -2. - . 125-132, 1. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6