Способ выявления у млекопитающего алло-антител к фактору VIII, аминокислотные последовательности, способные ингибировать расщепление молекулы фактора VIII и их применение

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ У МЛЕКОПИТАЮЩЕГО АЛЛО-АНТИТЕЛ К ФАКТОРУ , АМИНОКИСЛОТНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, СПОСОБНЫЕ ИНГИБИРОВАТЬ РАСЩЕПЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЫ ФАКТОРАИ ИХ ПРИМЕНЕНИЕ(71) Заявители ИНСТИТУТ НАЦИОНАЛЬ ДЕ ЛЯ САНТДЕ ЛЯ РЕЧЕРКЕ МЕДИКАЛЕ (ИНСЕРМ) БАЙЕР ФАРМА(73) Патентообладатели ИНСТИТУТ НАЦИОНАЛЬ ДЕ ЛЯ САНТДЕ ЛЯ РЕЧЕРКЕ МЕДИКАЛЕ (ИНСЕРМ) БАЙЕР ФАРМА(57) 1. Способ выявления у млекопитающего алло-антител к фактору , обладающих способностью катализировать расщепление молекулы фактора , включающий следующие этапы) выделение плазмы из образца крови млекопитающего с гемофилией А после введения фактора) выделение из плазмы алло-антител к фактору) инкубирование алло-антител к факторусовместно с факторомв течение времени, достаточного для катализации расщепления факторауказанными аллоантителами к факторуи) определение эффективности катализации расщепления фактора . 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на этапепроводят аффинную хроматографию. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что аффинную хроматографию проводят на матрице сефарозы, предпочтительно активированной цианоген-бромидом, с которой ковалентно связан фактор . 4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что выделенные на этапеалло-антитела к факторусмешивают с фактором , предпочтительно связанным с матрицей. 5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что на этапеиспользуют фактор , меченный радиоактивным агентом, предпочтительно 125. 6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что на этапеалло-антитела к факторуинкубируют совместно с факторомв течение приблизительно от 0,5 до 30 ч, предпочтительно около 10 ч, при температуре приблизительно от 15 до 40 С, предпочтительно при 38 С. 7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что эффективность катализации расщепления на этапеопределяют с помощью электрофореза в геле, предпочтительно-, или гель-фильтрации, предпочтительно быстрой жидкостной гельфильтрационной хроматографии белков с последующей авторадиографией. 8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что дополнительно включает) определение расположения связей, по которым алло-антитело к факторукатализирует расщепление молекулы фактора . 9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что на этапефакторинкубируют совместно с алло-антителами к фактору , а затем разделяют и секвенируют полученные фрагменты фактора . 10. Способ по п. 8 или 9, отличающийся тем, что разделение алло-антител к факторуи факторапроводят с помощью электрофореза в геле, предпочтительно . 11. Способ по любому из пп. 8-10, отличающийся тем, что используют -концевое секвенирование, предпочтительно с помощью автоматического белкового микросеквенатора. 12. Способ по любому из пп. 8-11, отличающийся тем, что выявляют алло-антитела,катализирующие расщепление молекулы факторапо связям 372-373, находящейся между доменами А 1 и А 2, 1680-1681, находящейся на -конце домена 3, и 1794-1795, находящейся внутри домена 3 молекулы фактора . 13. Аминокислотная последовательностьили ее пептидный аналог, способные ингибировать расщепление молекулы факторав сайтах, чувствительных к лизису алло-антителами к фактору . 14. Аминокислотная последовательностьили ее пептидный аналог, способные ингибировать расщепление молекулы факторав сайтах, чувствительных к лизису алло-антителами к фактору . 15. Аминокислотная последовательность 10097 1 2007.12.30 или ее пептидный аналог, способные ингибировать расщепление молекулы факторав сайтах, чувствительных к лизису алло-антителами к фактору . 16. Применение ингибитора расщепления факторав качестве вещества, нейтрализующего каталитические алло-антитела к фактору . 17. Применение по п. 16, отличающееся тем, что ингибитор включает ингибитор протеазы, предпочтительно 4-(2-аминоэтил)бензилсульфонилфторида гидрохлорид. 18. Применение по п. 16 или 17, отличающееся тем, что ингибитор ингибирует расщепление молекулы факторапо связям 372-373, находящейся между доменами А 1 и А 2, 1680-1681, находящейся на -конце домена 3, и 1794-1795, находящейся внутри домена 3 молекулы фактора . 19. Применение по любому из пп. 16-18, отличающееся тем, что ингибитор включает пептидный аналог аминокислотной последовательности. 20. Применение по любому из пп. 16-18, отличающееся тем, что ингибитор включает пептидный аналог аминокислотной последовательности. 21. Применение по любому из пп. 16-18, отличающееся тем, что ингибитор включает пептидный аналог аминокислотной последовательности. 22. Фармацевтическая композиция, обладающая способностью расщеплять молекулу фактора , содержащая в качестве активного компонента фармацевтически эффективное количество алло-антител к фактору , выявленных способом по любому из пп. 1-7. 23. Применение алло-антител, обладающих способностью катализировать расщепление молекулы фактора , в качестве компонента фармацевтической композиции для лечения млекопитающего с патологией, вызванной недостатком или избытком факторав крови. 24. Применение по п. 23, отличающееся тем, что указанная патология является результатом избытка факторав крови млекопитающего. 25. Применение по п. 23 или 24, отличающееся тем, что указанная патология представляет собой заболевание тромбозной природы, в частности тромбоз. 26. Фармацевтическая композиция, обладающая способностью ингибировать расщепление молекулы фактора , содержащая в качестве активного компонента фармацевтически эффективное количество ингибитора расщепления фактора . 27. Применение ингибитора расщепления факторав качестве компонента фармацевтической композиции для лечения млекопитающего с патологией, вызванной недостатком факторав крови. 28. Применение по п. 27, отличающееся тем, что ингибитор включает ингибитор протеазы, предпочтительно 4-(2-аминоэтил)бензилсульфонилфторида гидрохлорид. 29. Применение по п. 27 или 28, отличающееся тем, что ингибитор ингибирует расщепление молекулы факторапо связям 372-373, находящейся между доменами А 1 и А 2, 1680-1681, находящейся на -конце домена 3, и 1794-1795, находящейся внутри домена 3 молекулы фактора . 30. Применение по любому из пп. 27-29, отличающееся тем, что ингибитор включает пептидный аналог аминокислотной последовательности. 31. Применение по любому из пп. 27-29, отличающееся тем, что ингибитор включает пептидный аналог аминокислотной последовательности. 32. Применение по любому из пп. 27-29, отличающееся тем, что ингибитор включает пептидный аналог аминокислотной последовательности. 3 10097 1 2007.12.30 33. Применение по любому из пп. 27-32, отличающееся тем, что указанная патология представляет собой заболевание, связанное с дефектами свертывания крови, предпочтительно гемофилию А. 34. Ингибитор катализируемого алло-антителами к факторурасщепления молекулы фактора , включающий пептидный аналог аминокислотной последовательности. 35. Ингибитор катализируемого алло-антителами к факторурасщепления молекулы фактора , включающий пептидный аналог аминокислотной последовательности. 36. Ингибитор катализируемого алло-антителами к факторурасщепления молекулы фактора , включающий пептидный аналог аминокислотной последовательности. 37. Фармацевтическая композиция, обладающая способностью восполнять дефицит факторав крови, содержащая в качестве активного компонента фармацевтически эффективное количество ингибитора расщепления факторапо любому из пп. 34-36 или аминокислотной последовательности, или ее пептидного аналога по любому из пп. 13-15. 38. Фармацевтическая композиция по п. 37, отличающаяся тем, что ингибитор включает ингибитор протеазы, предпочтительно 4-(2-аминоэтил)бензилсульфонилфторидгидрохлорид. 39. Фармацевтическая композиция по п. 37 или 38, отличающаяся тем, что ингибитор ингибирует расщепление молекулы факторапо связям 372-373, находящейся между доменами А 1 и А 2, 1680-1681, находящейся на -конце домена 3, и 17941795, находящейся внутри домена 3 молекулы фактора . 40. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 37-39, отличающаяся тем, что она содержит аминокислотную последовательность или ее пептидный аналог по любому из пп. 13-15. Настоящее изобретение относится к способу определения наличия у млекопитающего каталитических алло-антител к фактору , способных расщеплять фактор , и получения характеристик сайтов расщепления молекулы указанного факторауказанными каталитическими антителами к фактору . Настоящее изобретение относится также к ингибитору расщепления (деградации) фактора , катализируемого алло-антителами к фактору . Далее, настоящее изобретение относится к фармацевтическому составу, содержащему указанные каталитические алло-антитела к фактору , которые способны расщеплять фактори которые получены в процессе осуществления указанного способа определения, и к фармацевтической композиции, содержащей указанный ингибитор расщепления фактора , катализируемого алло-антителами к фактору . Наконец, настоящее изобретение относится к терапевтическому применению указанного ингибитора расщепления фактора , катализируемого алло-антителами к фактору, фармацевтической композиции, содержащей указанные каталитические аллоантитела к фактору , которые способны расщеплять фактори которые получены в процессе осуществления указанного способа определения, и фармацевтической композиции, содержащей указанный ингибитор расщепления фактора , катализируемого аллоантителами к фактору . Гемофилия А - это связанное с Х-хромосомой рецессивное нарушение, приводящее к дефектности или дефициту молекул фактора , которое в острой форме является опасным для жизни и лишающим трудоспособности геморрагическим заболеванием. Вливание пациентам с острой гемофилией А гомологичного факторав 25 случаев приводит к появлению алло-антител к фактору( .,.,.,4 10097 1 2007.12.30.,.,Т.,В... // . 1992. . 339. . 594-598), которые ингибируют прокоагулянтную активность фактора , создавая стерические препятствия взаимодействию факторасо стабилизирующими молекулами ( , .,.2. // . . . 1994. . 269. С. 11601-11605 и, .,.-. // . . . 1996. . 271. С. 27424-27431), с необходимыми для его активности молекулами ( .,.. // . . . 1989. . 83. С. 1978-1984 и.,,.,... // . 1998. . 92. . 136-142) или с активирующими молекулами ( ,.,. // . 1989. . 73. С. 497499 и. --. // . . . 1992.. 296. С. 426-434). Заявителями было сделано открытие, не вытекавшее из предыдущего опыта, о расщеплении фактораалло-антителами двух пациентов с высоким иммунным ответом,имеющих острую гемофилию А, что выявило неизвестный доселе механизм, по которому ингибиторы факторамогут препятствовать прокоагулянтной функции фактора . Открытие заявителями каталитических алло-антител к факторуявляется, насколько известно, первым описанием появления каталитических антител, которые индуцируются при введении пациентам фактора . Поэтому считалось неожиданным, даже абсурдным или невероятным, что в присутствии фактораобразуются антитела, которые действительно делают молекулу факторанеактивной путем каталитического гидролиза (протеолиза). Однако известные до настоящего времени каталитические антитела все являются аутоантителами, обнаруживаемыми в процессе заболевания или при физиологических условиях. Поэтому все индуцируемые антитела названы АЛЛО-антителами,происхождение которых явно отличается от происхождения АУТО-антител в любом аутоиммунном заболевании. Рассчитанные значения средней К и кажущейсядля реакции антител к факторуодного из пациентов составляли соответственно 9,465,62 мкМ и 8560 фемтомольмин-1. Кинетические параметры гидролиза факторазаставляют предположить наличие функциональной роли каталитического иммунного ответа в инактивации фактора. Поэтому получение характеристики алло-антител к факторукак сайтспецифических протеаз обеспечивает новые подходы к лечению заболеваний у пациентов,имеющих алло-антитела к фактору . Таким образом, в соответствии с первым аспектом, настоящее изобретение предусматривает способ определения наличия у млекопитающего каталитических алло-антител к фактору , способных расщеплять фактор , отличающийся тем, что он включает) выделение плазмы из образца крови, взятого у указанного млекопитающего) выделение из указанной плазмы алло-антител к фактору) приведение указанных алло-антител к факторув контакт с факторомна период времени, достаточный для обеспечения расщепления указанного факторауказанными алло-антителами к факторуи) определение, после указанного периода времени, эффективно ли указанные аллоантитела к факторурасщепили указанный фактор . 5 10097 1 2007.12.30 Согласно варианту осуществления этапаспособа по настоящему изобретению, алло-антитела к факторувыделяют из плазмы, объединяя их с фактором , причем указанный факторпредпочтительно связан с носителем (матриксом). Удобно, чтобы на этапеалло-антитела к факторубыли выделены с помощью аффинной хроматографии. Предпочтительно, чтобы на этапеуказанная аффинная хроматография включала использование в качестве носителя сефарозы, предпочтительно активированной цианоген-бромидом. Согласно варианту осуществления этапаспособа по настоящему изобретению,указанный факторпомечен метящим агентом, предпочтительно радиоактивнометящим агентом - таким, в частности, как 125. Предпочтительно, чтобы на этапеуказанный факторбыл приведен в контакт с алло-антителами к факторуна период времени от приблизительно 0,5 ч до приблизительно 30 ч, предпочтительно около 10 ч,при температуре от приблизительно 15 до приблизительно 40 С, предпочтительно 38 С. Согласно варианту осуществления этапаспособа по настоящему изобретению, определение того, эффективно ли указанный факторбыл расщеплен указанными аллоантителами к фактору , проводится способом определения, включающим метод разделения - такой, как электрофорез в геле, как, в частности, электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (-), или гель-фильтрационная хроматография - такая, как, в частности, быстрая жидкостная гель-фильтрационная хроматография белков, и технику визуализации - такую, как, в частности, авторадиография. В соответствии со следующим вариантом осуществления способа по настоящему изобретению, для этого способа характерно то, что он дополнительно включает) получение характеристик сайта (сайтов) молекулы указанного фактора , в котором (которых) происходит расщепление указанными алло-антителами к указанному фактору . Согласно варианту осуществления этапаспособа по настоящему изобретению, указанное получение характеристик осуществляют, приводя указанный факторв контакт с указанными алло-антителами к фактору , способными расщеплять фактор , разделяя и затем секвенируя полученные вследствие такой процедуры фрагменты фактора. Удобно осуществлять такое разделение, используя такую технику, как электрофорез в геле - такой, как, в частности, -, или гель-фильтрацию. Указанное секвенирование удобно осуществлять, используя такую технику, как -концевое секвенирование, в частности с использованием автоматического белкового микросеквенатора. С использованием указанного секвенирования локализованы следующие способные к расщеплению связи 372-373, находящаяся между доменами А 1 и А 2, 1680-1681, находящаяся на -конце домена 3, и 1794-1795, находящаяся внутри домена 3 молекулы фактора . Таким образом, согласно второму аспекту, настоящее изобретение предлагает аминокислотную последовательностьаминокислотную последовательностьи аминокислотную последовательность. Настоящее изобретение распространяется также на варианты или аналоги такой или любой иной последовательности фактора , которые способны ингибировать любой сайт в молекуле фактора , чувствительный к лизису алло-антителами к фактору . В контексте настоящего изобретения таким вариантом может быть, например, пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности, описанной выше, который ингибирует любой сайт в молекуле фактора , чувствительный к лизису аллоантителом к фактору . Таким вариантом может быть, например, вариант последова 6 10097 1 2007.12.30 тельности, который короче на несколько аминокислот, например на -конце, на С-конце или на обоих концах, или длиннее на несколько аминокислот (такие варианты можно получить химическим синтезом или ферментативным расщеплением существующей в природе молекулы), при условии, что этот вариант ингибирует любой сайт в молекуле фактора , чувствительный к лизису алло-антителами к фактору . Поэтому, согласно третьему аспекту, настоящее изобретение предусматривает ингибитор расщепления фактора , катализируемого алло-антителами к фактору . Предпочтительно этот ингибитор отличается тем, что он включает в себя ингибитор протеазы. Примерами ингибиторов протеазы, которые могут быть использованы в контексте настоящего изобретения как ингибиторы расщепления фактора , катализируемого аллоантителами к фактору , но не ограничиваясь ими, являются ингибиторы типа фторидов - такие, как, например,(фенилметилсульфонил-фторид) или(4-(2 аминоэтил)бензилсульфонилфторид гидрохлорид (особенно продаваемый фирмой, , , под товарным знаком ). Более конкретно, для этого ингибитора характерно, что указанный ингибитор ингибирует (подавляет) расщепление чувствительных к расщеплению связей 372-373, находящейся между доменами А 1 и А 2, 1680-1681, находящейся на -конце домена 3, и 1794-1795,находящейся внутри домена 3 молекулы фактора . Еще более предпочтительно, для этого ингибитора характерно то, что он представляет собой пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательностипептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательностиили пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности. Ингибиторы расщепления фактора , как они были определены выше, так же как и их соли замещения, в особенности их фармацевтически приемлемые соли замещения,имеют ценные фармакологические показатели, так как они проявляют нейтрализующую активность по отношению к алло-антителам к фактору . Эти свойства обосновывают их применение в терапии, и настоящее изобретение дополнительно относится к указанным выше ингибиторам расщепления фактора , а также к их солям замещения, в особенности к их фармацевтически приемлемым солям замещения, в качестве лекарств. Таким образом, они в особенности показаны для лечения заболеваний, в частности гемофилического происхождения, более конкретно - заболеваний, связанных с дефектами свертывания крови вследствие недостаточности фактора . Можно упомянуть в качестве примера применение указанных веществ для лечения, с одной стороны, пациентов с высоким иммунным ответом, имеющих такие заболевания,как, например, слабая или острая гемофилия А (в случаях, когда у этих пациентов обнаружены каталитические антитела), и/или, с другой стороны, пациентов, страдающих, к примеру, аутоиммунными заболеваниями (в случаях, когда у этих пациентов обнаружены каталитические антитела). Таким образом, согласно четвертому принципиальному аспекту, настоящее изобретение обеспечивает решение длительное время существовавшей проблемы создания фармацевтической композиции, отличающейся тем, что она содержит фармацевтически эффективное количество по меньшей мере одного типа алло-антител к фактору , способных расщеплять фактор , как определено выше, в особенности таких, какие можно получить в процессе описанного выше способа, или одной из их фармацевтически приемлемых солей, включенных в фармацевтически приемлемый наполнитель, растворитель или носитель. 10097 1 2007.12.30 Далее, согласно пятому принципиальному аспекту, настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, отличающуюся тем, что она содержит фармацевтически эффективное количество по меньшей мере одного ингибитора расщепления фактора , как он определен выше, или одной из его фармацевтически приемлемых солей замещения, включенной в фармацевтически приемлемый наполнитель, растворитель или носитель. Эти фармацевтические композиции могут вводиться, например, трансбуккальным,ректальным, парентеральным, трансдермальным, окулярным, назальным или ушным путем. Эти фармацевтические композиции могут быть твердым веществом или жидкостью и могут быть представлены в фармацевтических формах, используемых обычно в медицине человека, - таких, как, например, простые таблетки или таблетки с покрытием, желатиновые капсулы, гранулы, свечи, препараты для инъекции, трансдермальные системы (для введения через кожу), глазные капли, аэрозоли и распыляемые растворы, а также ушные капли. Их готовят обычным путем. Активное начало, состоящее из фармацевтически эффективного количества по меньшей мере одного из ингибиторов расщепления фактора, как они определены выше, или одной из его фармацевтически приемлемых солей замещения, может быть включено сюда вместе с используемыми обычно в фармацевтических композициях наполнителями - такими, как тальк, гуммиарабик, лактоза, крахмал,стеарат магния, поливидон, производные целлюлозы, кокосовое масло, полусинтетические глицериды, водные или неводные носители, жиры животного или растительного происхождения, гликоли, различные увлажняющие агенты, диспергаторы или эмульгаторы, силиконовые гели, некоторые полимеры или сополимеры, консерванты, ароматизаторы и красители. Предпочтительной фармацевтической формой является форма для инъекции. Настоящее изобретение распространяется также на фармацевтическую композицию с нейтрализующей активностью, которая может использоваться главным образом как подходящее лекарство для лечения таких заболеваний, как гемофилия А с продукцией аллоантител к фактору , аутоиммунные заболевания с алло-антителами к фактору(в случае, когда у этих пациентов обнаружены каталитические антитела), причем для указанной фармацевтической композиции характерно, что она содержит фармацевтически эффективное количество по меньшей мере одного указанного выше ингибитора расщепления фактораили одной из его фармацевтически приемлемых солей замещения,включенной в фармацевтически приемлемый наполнитель, растворитель или носитель. Изобретение распространяется также на способ терапевтического воздействия на млекопитающее, страдающее патологией, являющейся результатом уровня содержания в его крови фактора , отличающийся тем, что указанному млекопитающему вводится терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного ингибитора расщепления фактора , как он определен выше, или одной из его фармацевтически приемлемых солей замещения. Этот способ обеспечивает главным образом успешное лечение заболеваний гемофилической природы, в особенности патологий, вызванных недостатком факторав крови больного. Изобретение распространяется также на фармацевтическую композицию с противотромбозной активностью, которая может быть использована главным образом как полезное лекарство при таких заболеваниях как в особенности тромбоз, причем для указанной фармацевтической композиции характерно, что она содержит фармацевтически эффективное количество по меньшей мере одного типа алло-антител к фактору , способных расщеплять фактор , в особенности такого, какой может быть получен в процессе описанного выше способа, или одной из его фармацевтически приемлемых солей замещения,включенной в фармацевтически приемлемый наполнитель, растворитель или носитель. 8 10097 1 2007.12.30 Изобретение распространяется также на способ терапевтического воздействия на млекопитающих, для которого характерно то, что указанному млекопитающему вводят терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного типа алло-антител к фактору , как они определены выше, или одной из его фармацевтически приемлемых солей замещения. Этот способ обеспечивает главным образом успешное лечение заболеваний тромбозной природы, в особенности патологий, вызванных присутствием избытка факторав крови больного. В терапии человека и животных алло-антитела к факторуили ингибиторы расщепления фактора , как они определены выше, могут вводиться сами по себе или в соединении с физиологически активным наполнителем в любой форме, в частности орально в форме желатиновых капсул или таблеток или парентерально в форме растворов для инъекций. Можно рассматривать другие формы введения - такие, как препараты в виде свечей, мазей, кремов, гелей или аэрозолей. В контексте настоящего изобретения использованы следующие термины каталитические алло-антитела к фактору , который понимается как обозначающий антитела, нацеленные на фактор , наделенные каталитической активностью, индуцируемые у пациентов с гемофилией А при трансфузии терапевтических препаратов факторафактор , который понимается как обозначающий кофермент факторав ферментативном расщеплении факторав процессе свертывания крови расщепление фактора , который понимается как обозначающий создание фрагментов фактора , которые не появляются вследствие спонтанного гидролиза или гидролиза физиологически расщепляющими ферментами, например тромбином, активированным фактором , активированным фактороми активированным белком С ингибитор расщепления фактора , катализируемый алло-антителами к фактору, который понимается как обозначающий любой пептид, принадлежащий или не принадлежащий к аминокислотной последовательности фактора , или ингибитор протеазы, который способен специфически нейтрализовать гидролизующую активность каталитических антител к фактору . В рекомбинантный факторчеловека была введена радиоактивная метка 125. Аллоантитела к факторубыли выделены и очищены из плазмы трех пациентов с гемофилией и ингибированием с помощью аффинной хроматографии на сефарозе , к матриксу которой был пришит очищенный иммунологическим методом факторчеловека. Аффинно очищенные антитела к факторупациентов Во,иингибировали прокоагулянтную активность факторадо уровня соответственно 57,0, 64,0 и 43,0/мг (единицна мг) . Совместная инкубация меченого факторас алло-антителами к факторуприводила, у двух пациентов из троих, к протеолизу молекулы. Была продемонстрирована специфичность гидролиза в сайтах объединения антител для алло-антител изотипак фактору . Совместная инкубация 125-факторас аффинно очищеннымк факторупациентов Во ив присутствии ингибиторов протеазы апротинина(0,15 мкМ), Е-64 (28 мкМ),(1,3 мкМ), лейпептина (10 мкМ) и пепстатина (10 мкМ) не приводила к ингибированию протеолитической активности. Заявители охарактеризовали главные сайты расщепления каталитическимв молекуле факторакак следующие 372-373, находящийся между доменами А 1 и А 2 фактора , Ту 1680-1681, находящийся на -конце домена 3, и 1794-1795, находящийся внутри домена 3. Была продемонстрирована зависимость гидролиза фактораалло-антителами к факторуот времени и дозы. В частности, гидролиз наблюдался в условиях, когдак факторуи факторинкубировали совместно при молярных соотношениях, кото 9 10097 1 2007.12.30 рые были в 80-9500 раз ниже, чем те, которые ожидались в плазме пациентов, что приводит к предположению, что гидролиз является механизмом инактивации факторааллоантителами пациентов. Далее заявители исследовали кинетику опосредованного антителами гидролиза фактора , инкубируяк факторупациентас возрастающими концентрациями немеченого факторав присутствии фиксированной концентрации 125-фактора . Кривые зависимости величины, обратной скорости, от величины, обратной концентрации субстрата, были линейными (0,99), что позволяет предположить, что реакция имеет простую кинетику Михаэлиса-Ментен, как уже наблюдалось для поликлональных каталитических антител. Для пациентабыли рассчитаны кажущаяся каталитическая эффективность,и скорость гидролиза алло-антителами к фактору . На основании рассчитанных кинетических параметров гидролизабыло сделано предположение,что механизмом инактивации фактораалло-антителами пациентовможет быть протеолиз. Ассоциация факторас фактором фон Виллебрандаповышает каталитическую скорость тромбина по отношению к фактору , поскольку он защищает факторот гидролиза активированным белком С (АРС). Добавлениек факторуприводило к частичному ингибированию (т.е. на 36,9 ) гидролиза фактораиммуноглобулиномк фактору , если очищенныйи факторсмешивали в весовом соотношении, близком к их соотношению в нормальной плазме, т.е. 30 мкг/мли 300 нг/мл фактора . Идентификация алло-антител к факторукак каталитических антител, в добавление к описанным ранее гидролизующим антителам к вазоактивному кишечному пептиду у пациентов с астмой, гидролизующим ДНК антителам у пациентов с системной красной волчанкой и тироглобулин-специфичным каталитическим антителам у пациентов с аутоиммунным тиреоидитом, расширяет спектр каталитических иммунных ответов. Насколько известно заявителям, это первое свидетельство индукции у человека каталитических антител в ответ на экзогенное введение белкового антигена. Кинетические параметры гидролиза факторапроявляющим каталитические свойствак факторуи оценка количеств этих антител в плазме позволяют предположить наличие у каталитического иммунного ответа функциональной роли в инактивации фактора. В поликлональной смеси алло-антител к фактору , различающихся по их функциональным свойствам, каталитические антитела могут ингибировать прокоагулянтную активность факторас большей скоростью, чем некатализирующие антитела к фактору. Таким образом, идентификация пептидных эпитопов, являющихся мишенями для протеолитических антител к фактору , может быть решающей для понимания патофизиологии ответа с наличием ингибитора фактора . Кроме того, получение характеристик ингибиторов факторакак сайт-специфических протеаз обеспечивает новые подходы к лечению пациентов, имеющих алло-антитела к фактору . Для лучшего понимания настоящего изобретения и более ясного представления о его целях, характерных особенностях и преимуществах приведено нижеследующее объяснительное описание со ссылками на приложенные фигуры, которые даны исключительно как неограничивающие примеры, иллюстрирующие специфичность расщепления фактораалло-антителами к фактору . Фиг. 1 гидролиз 125-факторааффинно очищенными антителамик факторупациентов с гемофилией А с ингибитором. Фиг. 1 (А) меченый 125 факторинкубировали с аффинно очищеннымк факторупациентов Во (полоса ),(полоса ) и(полоса ) или только с буфером (полоса 1) в течение 10 ч при 38 С, затем проводили - и авторадиографию. Для двух из троих пациентов (Во и ) инкубация факторас аффинно очищеннымк факторуприводила к гидролизу молекулы фактора . Наоборот,10 10097 1 2007.12.30 профиль миграции в геле факторане изменялся, если меченый 125 факторинкубировали ск фактору , очищенным из плазмы пациента(полоса ). Профиль миграции факторане изменялся также и при инкубации с моноклональным 061 человека к дигоксинуили с нормальным нефракционированным поликлональнымчеловека (, ), не проявляющим ингибирующей активности по отношению к фактору . Фиг. 1 (В) фракции протока через аффинные колонки не содержали антител к фактору , определяемых методом твердофазного иммуноферментного анализа , и не гидролизовали меченый 125 фактор . Фиг. 1 (С) удалениеиз кислотных элюатов, содержащих аффинно очищенные антитела к факторуот пациентови Во, хроматографией на белкеприводило к потере их гидролитической активности по отношению к фактору . Фиг. 2 гель-проникающая хроматография каталитической активности антител к фактору . Фиг. 2 (А) чтобы дополнительно исключить вероятность того, что протеолитическая активность антител обусловлена примесными протеазами, аффинно очищенные антитела к факторупациентаобрабатывали 8 М мочевиной и подвергали гельпроникающей хроматографии. Основной пик содержался во фракции 25, которая соответствуетпо тесту . Гидролизующая активность элюировалась во фракции , и таковая активность не обнаруживалась во фракциях, в которых отсутствовал(например, фракция 35). Фиг. 2 (В) основной пик, выделенный во фракции 25, соответствовал , как свидетельствует - несущего радиоактивную метку содержимого фракции. Фиг. 3 зависимость протеолиза 125-факторааффинно очищенными антителами к факторупациентов с гемофилией А с ингибитором от дозы и от времени. Кинетика гидролиза фактораалло-антителами к факторупациентов Во и. Скорость гидролиза меченого 125 фактораиммуноглобулиномк факторупациентабыла выше, чем скорость гидролиза, проявляемая иммуноглобулиномк факторупациента Во это позволяет предположить, что каталитические антитела пациентов имеют различные кинетические свойства, или, альтернативно, что доля каталитических антител среди антител к факторуу пациентов различается. Фиг. 4 гидролиз 125-фактораантителами к факторув присутствии возрастающих количеств необработанного (немеченого) фактора . Кинетика опосредованного антителами гидролиза факторапри инкубированиик факторуу пациентас возрастанием концентрации немеченого факторав присутствии фиксированной концентрации 125-фактора . Добавление возрастающих концентраций количеств немеченого фактораприводило к зависимому от дозы ингибированию гидролиза 125-фактораиммуноглобулиномк фактору . Насыщения гидролиза факторане было достигнуто при максимальной концентрации,которая была использована (т.е. при 1,7 мкМ). График зависимости величины, обратной скорости, от величины, обратной концентрации субстрата, был линейным (0,99), что свидетельствует о том, что реакция имеет простую кинетику Михаэлиса-Ментен, как уже наблюдалось для поликлональных каталитических антител. Фиг. 5 ингибирование каталитической активностик факторупациента . Протеолиз несущего радиоактивную метку фактораалло-антителами к факторупациентаподавлялся до приблизительно 62 , если антитела и факторсовместно инкубировали в присутствии(продукт фирмы ) это указывает на активность определенного ингибитора протеазы в нейтрализации каталитической активности некоторых из каталитических антител. Примеры. Пример 1. Аффинная очистка антител к фактору . 11 10097 1 2007.12.30 Антитела выделяли из плазмы осаждением сульфатом аммония. Затем антитела, реагирующие с фактором , очищали аффинной хроматографией на матрице активированнойсефарозы 4 В, к которой был пришит очищенный иммунологическим методом промышленно выпускаемый фактор , полученный из плазмы человека (25000 ед./3 г геля). Собирали фракции протока через колонку. После тщательной промывки фосфатнобуферным солевым растворомрН 7,4 антитела к факторуэлюировали раствором 0,2 М глицина рН 2,8, диализовали противи концентрировали с помощью . Отбирали пробы из фракций протока и элюатов и хранили их до использования при,ибыло равно соответственно 130, 20 и 280 мкг (то есть 143130 мкг/мл нефракционированной плазмы), что согласуется с предшествующими наблюдениями. Пример 2. Нейтрализующая активность по отношению к фактору . Нейтрализующую активность по отношению к факторуантител к факторуопределяли методоми др. и выражали в единицах(ссылка).определяли как величину, обратную концентрации , дающей 50 ингибирование прокоагулянтной активности фактора . Остаточную активность фактораизмеряли в одноступенчатом анализе путем измерения времени активированного частичного тромбопластина, используя в качестве субстрата лишенную факторачеловеческую плазму, а в качестве активатора -плаценты человека . Испытуемые прогретую плазму или иммунологически очищенныйк факторуинкубировали с объединенной, обработанной цитратом человеческой плазмой в течение 2 ч при 37 С. Время свертывания для четырех последовательных разведений референсного образца плазмы ( , ) сравнивали со временем свертывания трех разведений каждого испытуемого образца. Разведения делали в буфере - (). Расхождения между повторами составляли от 1 до 2,5 . Аффинно очищенные антитела к факторупациентов ,иингибировали прокоагулянтную активность факторасоответственно до 57,0, 64,0 и 43,0 /мг . Пример 3. Оценка гидролиза фактора . Промышленно выпускаемый рекомбинантный факторчеловека метили 125 иодогенным методом до удельной активности 11,6 нКюри/мкг. 25-фактор(от 1,5 до 150 нг) инкубировали в 50 мкл буфера 50 мМ трис- рН 7,7, 100 мМ глицин, 0,025 твин-20 и 0,023 без или с добавлением от 17 до 1667 нМ иммунологически очищенногок факторув течение от 5 мин до 10 ч при 38 С. Моноклональный 061 человека к дигоксинуи нормальный нефракционированный человеческий поликлональный(, ) использовали в качестве негативных контролей. Пробы смешивали в отношении 11 с буфером Лэмли без меркаптоэтанола и после нанесения в ячейки 20 мкл каждой пробы подвергали их без кипячения электрофорезу в присутствии . Электрофорез проводили параллельно в 7,5 и 15 гелях спри невосстанавливающих условиях. Электрофорез проводили при комнатной температуре с помощью системы -при 25 мА/гель до достижения фронтом красителя низа геля. Затем гели сушили и зоны белка проявляли с помощью Х-ОМАТ . После авторадиографии сканировали зоны факторас кажущимся молекулярным весом 200 и 300 кДа, которые всегда гидролизуютсяк фактору , чтобы иметь возможность рассчитать скорость гидролиза меченого фактора . Пример 4. Быстрая гель-фильтрационная жидкостная хроматография белка. Аликвоту 100 мклк факторупациента(740 мкг), обработанную 8 М мочевиной, подвергали гель-фильтрации на колонке с суперозой-12, уравновешеннойс 0,01 азида, при скорости протока 0,2 мл/мин. Собирали фракции объемом 500 мкл и после 10-кратного разбавления анализировали их на наличиеметодом -сэндвич и на протеолитическую активность по отношению к фактору . Белки во фракции 25 метили 125 и подвергали - при невосстанавливающих условиях параллельно с 12 10097 1 2007.12.30 нормальным поликлональнымчеловека. Гель окрашивали красителем кумасси голубым, а также авторадиографировали затем оба изображения совмещали. Основной пик,выделенный во фракции 25, соответствовалсогласнои - меченого содержимого фракции. Гидролизующая активность элюировалась совместно с фракциейи не обнаруживалась во фракциях, в которых отсутствовал(например, фракция 35). Пример 5. Анализ последовательностей Н 2-конца. Сахарозный состав с немеченым рекомбинантным фактором(-)(300 мкг,,, , , США) обрабатывалик факторупациента(74 мкг) в 1500 мкл буфера 50 мМ трис- рН 7,7, 100 мМ глицин,0,025 твин-20 и 0,023 в течение 24 ч при 38 С. Полученные фрагменты фактораподвергали - в 10 геле при 50 мА в невосстанавливающих условиях и переносили в течение 2 ч при 100 мА на мембрану -(,, Англия) в 10 мМи 10 этаноле при рН 11,0. После окрашивания кумасси голубым видимые зоны вырезали и проводили -концевое секвенирование с помощью автоматического белкового микросеквенатора 492(- , , , ). Количество секвенированного белка, в зависимости от фрагмента,варьировало от 0,5 до 2 пикомолей. Основными доступными для расщепления связями были следующие 372-373 372 373( - ), находящаяся между доменами А 1 и А 2 фактора , Ту 1680-1681 (16801681), находящаяся на -конце домена 3, и 1794-1795 (1794-1795), находящаяся внутри домена 3. Несколько сайтов расщепления фактораантителами к факторумогут иметь происхождение от индивидуальных антител с полиспецифической каталитической активностью или же поликлональных популяций антител, каждый тип из которых имеет уникальную специфичность в смысле сайта расщепления. Аминокислотная последовательность Пример 6. Исследование ингибирования проведено с помощью- общего ингибитора сериновых протеаз. Гидролиз 125-факторааффинно очищенными антителамик факторупациентов с гемофилией А с ингибитором в присутствии .25-Фактор(150 нг) инкубировали отдельно, в присутствии 50 мкг/мл иммунологически очищенногок факторупациентаили в присутствии ик фактору , и ингибитора сериновых протеазв течение 5 ч при 38 С. Затем факторанализировали с помощью - в 7,5 геле при невосстанавливающих условиях. После авторадиографии зоны факторас кажущимся молекулярным весом 200 и 300 кДа,неизменно гидролизуемыек фактору , сканировали, чтобы вычислить процент гидролиза меченого фактора . Протеолиз радиоактивно меченого фактораалло-антителами к факторупациентабыл ингибирован до уровня приблизительно 62 в том случае, когда антитела и факторинкубировали совместно в присутствии , что указывало на способность некоего ингибитора сериновых протеаз нейтрализовать каталитическую активность некоторых каталитических антител. 10097 1 2007.12.30 Дальнейшие наблюдения. При скрининге очищенныхот десяти имеющих высокий иммунный ответ пациентов с гемофилией А при использовании в качестве молекулы-мишени меченого 125 факторадля шести пациентов наблюдали изменения в профиле миграции фактора . Эти результаты подкрепляют предыдущие наблюдения заявителей и указывают на то, что каталитические антитела к факторуимеются приблизительно у 60 пациентов. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 14