Способ определения количества внесенной фолиевой кислоты в обогащенных молочных продуктах

(51) С 011 30/02 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНтР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОИ СОБСТВЕННОСТИ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ВНЕСЕННОЙ ФОЛИЕВОИ КИСЛОТЫ В ОБОГАЩЕННЫХ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены (ВУ)(72) Авторы Шуляковская Ольга Васильевна Белыщева Людмила Леонидовна Соколов Сергей Михайлович Воронцова Ольга СергеевнаЖданов Ю.И. и др. Медицинская наука и ее связь с практическим здравоохранением Тезисы докладов республиканской научно-практической конфе Полянских Елена Ильинична (ВУ) ренции. - Витебск, 1998. - С. 41. Экспериментальная витаминология. Минск Наука и техника, 1979. - С. 353389.Способ определения количества внесенной фолиевой кислоты в обогащенных молочных продуктах, включающий экстракцию фолиевой кислоты, очистку и концентрирование полученного экстракта на колонке, заполненной анионитом ФИБАН А-6, и определение массовой концентрации фолиевой кислоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.Известен способ определения фолиевой кислоты в печени и крови, основанный на ферментативном гидролизе, очистке гидролизата от примесей, окислении фолиевой кислоты в 2-амино-4-гидрокси-птеридин-6-карбоновую кислоту и измерении интенсивности флуоресценции образующегося соединения, которая прямо пропорциональна массовой доле фолиевой кислоты 1.Способ является аналогом по отношению к заявляемому.Однако указанный способ имеет ряд недостатков. Во-первых, ограничен определением фолиевой кислоты только в печени и крови. Во-вторых, ферментативный гидролизпроводится в течение 20-23 Ч, что значительно удлиняет время анализа. Кроме того, необходим ферментный препарат из почек свиней.Известен способ определения фолиевой Кислоты в сухом молочном порошке, включающий экстракцию с ферментативнь 1 м гидролизом, очистку гидролизата и измерение массовой концентрации фолиевой кислоты в сравнении со стандартным раствором с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 2.Указанный способ является прототипом по отношению к заявленному. Однако к недостаткам известного способа относятся длительное время ферментативного гидролиза,что удлиняет время анализа, а кроме того, большое количество используемых дорогостоящих реактивов и ферментов.Задачей заявляемого изобретения является сокращение времени анализа за счет исключения стадии гидролиза, уменьшение количества используемых реактивов без снижения точности определения.Поставленная задача достигается следующим образом.Предложен способ определения количества внесенной фолиевой кислоты в обогащенных молочных продуктах, включающий экстракцию фолиевой кислоты, очистку и концентрирование полученного экстракта на колонке, заполненной анионитом ФИБАН А-6,и определение массовой концентрации фолиевой кислоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.Пример. Определение фолиевой кислоты в обогащенных молочных продуктах.Навеску образца массой 40-50 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 смз,вносят 50 см 3 ацетонитрила, интенсивно встряхивают 1-2 мин. Оставляют стоять на 10 мин,затем фильтруют через бумажный фильтр (синяя лента) или центрифугируют. Замеряют общий объем экстракта.50 смз экстракта, полученного по п. 1, пропускают через хроматографическую колонку, заполненную анионитом ФИБАН А-6, подготовленную соответствующим образом со скоростью 1 капля в секунду. Элюируют фолиевую кислоту из хроматографической колонки 7 см 3 15 раствора 1 ТаС 1 с рН 9.Включают хроматограф согласно инструкции по эксплуатации, устанавливают рабочие режимы для детектора и насоса. Прокачивают через колонку смесь буферов в течение 0,5 ч до выхода прибора на режим и стабилизации процессов в колонке. Включают систему регистрации сигналов согласно инструкции по эксплуатации.Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади хроматографического пика от концентрации фолиевой кислоты в растворе, устанавливают по 6 точкам в диапазоне от 1,0 до 0,05 мкг/смз. Градуировочные растворы хроматографируют не менее 5 раз, начиная с самой низкой концентрации. Регистрацию сигнала, обработку и хранениеПримечание 0,5 г сухого анионита помещают в стеклянную или тефлоновую колонку с И 8-10 мм. Колонку заполняют 10 -ным раствором соляной кислоты и вь 1 держивают 15-20 мин, кислоту вымывают дистиллированной водой до рН 7. Далее колонку заполняют 2 н раствором ЫаОН и выдерживают 15-20 мин, затем отмывают от щелочи дистиллированной водой до рН 7. Потом колонку заполняют 10 -ным раствором соляной кислоты и выдерживают 15-20 мин, промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции. Затем пропускают экстракт для очистки и концентрирования через колонку с анионитом ФИБАН А-б.ПОЛУЧЕННОЙ информации ПрОВОДЯТ С использованием КОМПЬЮТЕРНОЙ СИСТЕМЫ. Площадь пика стандарта ВЫЧИСЛЯЮТ ОбЩСПрИНЯТЫМИ методами.Затем строится градуировочная зависимость величины отклика детектора от концентрации фолиевой кислоты. Условия хроматографического анализаобъем вводимой в хроматограф пробы 0,02 смз расход буфера 0,5 см 3/мин температура колонки 20 1 5 С длина волны детектора 286 нм подвижная фаза буферы А и Б.Время выхода фолиевой Кислоты устанавливают при проведении градуировочных работ.Подготовленную пробу по п. 2 (объем 7 смз) вводят в прибор в количестве 0,02 см 3. Анализ проводят при тех же условиях, что и калибровку (см. п. 3.2.). Вычисление площади пика фолиевой кислоты в пробе проводится системой регистрации, обработки и хранения спектрометрической информации.Массовую концентрацию фолиевой кислоты в образцах обогащенных молочных продуктов вычисляют по формулеХ 1 ОО, где Х - массовая концентрация фолиевой кислоты в пробе, мкг/ 100 г/2 - объем элюата, пропущенного через хроматографическую колонку, смз ш - масса навески пробы, г С - концентрация фолиевой кислоты, найденная по градуировочному графику, мкг/смз Уз - объем экстракта, взятого для элюирования, смз 74 - объем элюата, взятого для хроматографирования, смз 100 - коэффициент пересчета концентрации фолиевой кислоты на 100 г продукта. За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое значение(Х) результатов двух параллельных определений, рассчитанных до третьего и округленнь 1 х до второго десятичного знака. Результаты определения фолиевой кислоты в обогащенных молочных продуктах предлагаемым способом представлены в табл. 2. Таким образом, заявляемый способ обладает следующими преимуществами исключает стадию ферментативного гидролиза и упрощает стадию экстракции сокращает время анализа в 4 раза уменьщает количество используемых дорогостоящих реактивов в 4,5 раза не снижает точность измерений по сравнению с прототипом.Таблица 2 Определение фолиевой кислоты в обогащенных молочных продуктах. Ацетат ртути Предлагаемый 0 1. Ацетонитрил 2. Анионит ФИБАН А-б 3. Соляная кислота 4. Гидроксид натрия2. Ег 11 .М. Копйпз. А Уайбагеб ЫЧЦШ Сшошатогарййс Метод Тог Вегегшйпш Ро 1 агез 111 Уеегаыез, МШ Рои/бег, Ыуег, апб Р 1 о 11 г// 1. оГ АОАС 1 пгегпайопа 1. - Уо 1. 82, Но. 1. 1999. - Р. 119-127 (прототип).Национальный Центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.