Способ получения каллусной культуры адониса весеннего Adonis vernalis L.

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ АДОНИСА ВЕСЕННЕГО.(71) Заявитель Государственное научное учреждение Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Кутас Елена Николаевна Малахова Ирина Николаевна Горецкая Анастасия Антоновна Кухарева Лидия Васильевна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси(57) Способ получения каллусной культуры адониса весеннего., заключающийся в том, что подготавливают эксплант адониса весеннего путем отбора почки возобновления с растения адониса весеннего, промывки его проточной водой и слабым раствором марганцевокислого калия, стерилизации в 0,1 -ном растворе азотнокислого серебра в течение 5-8 мин и разрезания на пластины толщиной 2 мм, подготовленные пластины экспланта в стерильных условиях культивируют до образования каллуса на питательной среде с рН 6,0 следующего состава, мг/л среды 0,83 262 0,025 472 557 2 ЭДТА 745 мезоинозит 100 глицин 2 тиамин 1 пиридоксин 1 никотиновая кислота 1 азотнокислое серебро 10 сахароза 30 000 нафтилуксусная кислота 2 бензиламинопурин 1,5 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 1 агар 9 000,образовавшийся каллус культивируют в стерильных условиях до получения каллусной культуры на питательной среде с рН 6,0 следующего состава, мг/л среды 3 1900 43 1650 24 170 472 370 242 440 2422 0,25 452 0,025 33 6,2 452 24,1 472 8,6 18207 1 2014.06.30 при этом культивирование пластин экспланта и каллуса адониса весеннего осуществляют при флуоресцентном освещении 4000 лк с фотопериодом 16 ч при температуре 24 С и влажности воздуха 70 . Изобретение относится к сфере морфогенеза (каллусообразования) у растений. Область применения биотехнология, медицина, фармацевтическая промышленность. Известно, что. (горицвет весенний) является ценным лекарственным растением. Заготовка травы горицвета весеннего привела к истощению растительных ресурсов этого вида 3. Альтернативным источником сырья для фармацевтической промышленности может служить каллусная культура горицвета весеннего, содержащая биологически активные соединения. Каллус - это новообразование из паренхимных недифференцированных клеток на раневых поверхностях растения. Возникает в виде валика или аморфной массы в местах надрезов, трещин на концах черенков в культуре клеток и тканей. Особенно энергично каллус образуется тогда, когда в раневой зоне есть камбий. Каллусная ткань способствует зарастанию ран, срастанию прививок, образованию корней при вегетативном размножении растений. Известен способ получения каллусной ткани аконита из этого же семейства лютиковых, которая была получена из зрелых зародышей 1. Предварительно замоченные семена стерилизовали в течение 1 мин 70 -м этанолом и 15 мин 0,1 -м диацидом, затем промывали автоклавированной дистиллированной водой. Стерилизованные семена переносили на питательную среду Мурасиге и Скуга 2, не содержавшую фитогормонов. Тронувшиеся в рост зародыши затем пересаживали на среду Мурасиге и Скуга, дополненную ИУК (2 мг/л), кинетином (2 мг/л) и 2,4-Д (6 мг/л). Каллус культивировали в темноте на среде того же состава при температуре 22-24 С. Пересадку осуществляли каждые 21 сутки. Однако, что касается получения каллусной культуры горицвета весеннего, все попытки ее осуществления заканчивались неудачей. В научной и технической литературе не удалось найти описание подобного способа получения каллусной культуры адониса весеннего. Решение проблемы сводится к разработке способа получения каллусной культуры горицвета весеннего. Стремление исследователей получить каллусную культуру горицвета весеннего не имели успеха 4. Поставленная задача решается тем, что предложен способ получения каллусной культуры адониса весеннего (.) в условиях. Способ включает подготовку оборудования, приготовление питательной среды и ее автоклавирование,подготовку растительного материала (эксплантов), стерилизацию почек возобновления адониса весеннего, посадку эксплантов адониса на питательную среду, культивирование почек возобновления адониса весеннего (эксплантов), пересадку и культивирование каллуса. Способ получения каллусной культуры адониса весеннего ( ) включает приготовление питательной среды, используя маточные растворы макро- и микросолей,хелата железа, витамины по Уайту, мезоинозит, глицин, ИУК, кинетин, поливинилпирролидон, сахарозу, агар, этанол, азотнокислое серебро присреды 6,0. В результате экспериментальных исследований морфогенеза адониса весеннего разработаны различные модификации питательных сред, обеспечивающие получение каллусной культуры адониса весеннего в условиях. Схема получения каллуса адониса весеннего представлена на фигуре. Для осуществления способа получения каллусной культуры адониса весеннего требуется определенный набор посуды, инструментов, сырья и реактивов. 3 18207 1 2014.06.30 1. Используемое оборудование 1.1 ламинар-бокс 1.2 автоклав 1.3 весы лабораторные 1.4 дистиллятор 1.5 бидистиллятор 1.6 -метр 1.7 стеклянные цилиндры градуированные 25, 50 мл 1.8 стеклянные стаканы градуированные с носиком 50, 1000 мл 1.9 водяная баня 1.10 пипет-дозаторы на 200 мкл 1.11 пипет-дозаторы на 1000 мкл 1.12 конические колбы объемом 100 мл 1.13 стерильные скальпели 1.14 стерильные пинцеты 1.15 стерильные стеклянные чашки Петри диаметром 9 см 1.16 стеклянные палочки 1.17 спиртовка 1.18 алюминиевая фольга. 2. Используемое сырье и реактивы 2.1 почки возобновления адониса весеннего 2.2 вода дистиллированная 2.3 вода бидистиллированная 2.4 маточный раствор макросолей (табл. 1) 2.5 маточный раствор микросолей (табл. 2) 2.6 маточный раствор хелата железа (табл. 3) 2.7 модифицированная среда для индукции каллуса (табл. 4) 2.8 модифицированная среда для наращивания каллусной массы (табл. 5) 2.9 этанол 2.10 азотнокислое серебро. Таблица 1 Маточный раствор макросолейпп. 1 2 3 4 18207 1 2014.06.30 Таблица 2 Маточный раствор микросолейпп. 1 2 3 4 Маточный раствор хелата железапп. 1 2 Количество вещества мг на 100 мл бидистиллята 557 745 Таблица 4 Модифицированная среда для индукции каллуса адониса весеннего Компоненты среды Макросоли (маточный раствор) Микросоли (маточный раствор) Хелат железа (маточный раствор) Витамины по Уайту Мезоинозит Глицин НУК БАП 2,43 Сахароза Агар Концентрация компонентов среды (мл/л, мг/л) 50 1 5 1 100 мг 2 мг 2 мг 1,5 мг 1 мг 10 мг 30 000 мг 9 000 мг 6 Таблица 5 Модифицированная среда для наращивания каллусной массы адониса весеннего Компоненты среды Макросоли (маточный раствор) Микросоли (маточный раствор) Хелат железа (маточный раствор) Витамины по Уайту Мезоинозит Концентрация компонентов среды (мл/л, мг/л) 50 1 5 1 100 мг 5 Продолжение таблицы 5 Концентрация среды компонентов (мл/л, мг/л) 2 мг 3 мг 0,2 мг 10 мг 30 000 мг 9 000 мг 6 3. Ход технологического процесса. 3.1. Подготовка посуды и инструментов. Колбы, чашки Петри, мерные цилиндры, стаканы мыли с использованием стирального порошка, споласкивали 12 раз проточной водой и 2 раза - дистиллированой. Сухую, чистую посуду использовали для приготовления маточных растворов и питательной среды. Инструменты (пинцеты, скальпели) заворачивали в термостойкую бумагу и стерилизовали сухим жаром при температуре 180 С на протяжении 2 ч. Стерильные инструменты помещали в ламинар-бокс. 3.2. Приготовление питательной среды и ее автоклавирование. В соответствии с прописью питательной среды, составленной нами ранее (табл. 4) взвесили, растворили и прилили все необходимые компоненты в мерный стакан объемом 1 л, довелисреды до 6, разлили содержимое в пробирки (по 15 мл в каждую), закрыли фольгой и автоклавировали при давлении 0,75 атмосфер в течение 25 мин. Застывшую среду поместили в ламинар-бокс. 3.3. Подготовка растительного материала (эксплантов). Визуально выбирали растение адониса весеннего без видимых повреждений и отмечали его этикеткой. Летом в июле отбирали почки возобновления адониса весеннего. Предварительно их промывали в проточной воде, затем в слабом растворе марганцевокислого калия. 3.4. Стерилизация почек возобновления адониса весеннего. Почки стерилизовали в 0,1 -ном растворе азотнокислого серебра в течение 8 мин(крупные), 5-6 мин (мелкие) (с предварительным погружением в 70 этанол на 5 с), с последующей трехкратной промывкой в стерильной дистиллированной воде в течение 5, 10 и 15 мин соответственно. 3.5. Посадка эксплантов адониса весеннего на питательную среду. Стерильные почки возобновления разрезали острым скальпелем на пластинки толщиной 2 мм и помещали в пробирки одинакового объема по 15 мл питательной среды в каждой (состав питательной среды - табл. 4). Перед посадкой и окончанием посадки эксплантов горлышко каждой пробирки и фольгу обжигали над пламенем спиртовки. Эту же процедуру выполняли с инструментами. 3.6. Культивирование эксплантов адониса весеннего. Культивировали экспланты, высаженные на питательную среду, под флюоресцентным освещением с фотопериодом 16 ч, освещенностью 4000 лк при температуре 24 С и влажности воздуха 70 . По истечению 2 месяцев на эксплантах образовался каллус. 3.7. Пересадка и культивирование каллуса. Каллус, образовавшийся на эксплантах, помещали в колбы одинакового объема по 20 мл питательной среды в каждой (состав питательной среды - табл. 5). Колбы с каллусом помещали на стеллажи под флюоресцентное освещение с фотопериодом 16 ч, освещенностью 4000 лк при температуре 24 С и влажности воздуха 70 для наращивания каллусной массы. 18207 1 2014.06.30 4. Подготовка к работе. Подготовка персонала, оборудования к работе, уборка помещения осуществлялись в строгом соответствии с производственными инструкциями, разработанными и согласованными в установленном порядке. 5. Нормы расхода сырья и материалов. Нормы расхода сырья и вспомогательных материалов при получении каллусной культуры адониса весеннего приведены в табл. 6. Таблица 6 Наименование материалов, сырья Почки возобновления адониса весеннего,шт. 3, мг 43, мг 472, мг/ 4 безводный 242, мг/ 2, мг 24, мг 452, мг/ 44 2, мг 472, мг 33, мг Расход на одну посадку 10 1900 1650 370/180 440/332,5 170 24,10/22,30 8,6 6,2 0,83 0,025 0,25 0,025 55,7 74,5 100 1,00 1,00 1,00 10 000 30 000 2 2/3 1,5 0,2 1 9000 250 100 Источники информации 1. Лукичева И.А., Мигранова И.Г. Каллусная ткань, полученная из зрелых зародышей- перспективный источник алкалоида лаппаконитин // Вестник Башкирского университета. - 2001. -2 . - С. 94-95. 2..,. // . . - 1962. - . 15. - . 13. - . 473-497. 18207 1 2014.06.30 3. Парень М.И. Адонис весенний (.) в Украине (еколого-ценотичн особенности и охрана) Дис канд. биол. наук 03.00.05 / Национальный ботанический сад им. М.М. Гришка НАН Украины. - К., 2002. - С. 3-5. 4. Орлова И.Г., Атаманченко М.П. Биотехнологические методы в интродукции и сохранении биологического разнообразия растений.-2008. - ,, 2008. - С. 3-7. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8