Способ получения культуры ксеногенных тироцитов для лечения гипотиреоза у человека

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ КСЕНОГЕННЫХ ТИРОЦИТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГИПОТИРЕОЗА У ЧЕЛОВЕКА(71) Заявитель Учреждение образования Белорусский государственный медицинский университет(72) Авторы Третьяк Станислав Иванович Горанов Виталий Анатольевич Хрыщанович Владимир Янович(73) Патентообладатель Учреждение образования Белорусский государственный медицинский университет(57) Способ получения культуры ксеногенных тироцитов для лечения гипотиреоза у человека, заключающийся в том, что выделяют щитовидную железу у новорожденного кролика, промывают ее в холодной питательной среде 199 с антибиотиками, механически измельчают, инкубируют в растворе, содержащем 1 коллагеназы и 0,125 трипсина,при периодическом встряхивании в течение 15 минут при температуре 27 С, затем в течение 15 минут постепенно повышают температуру до 37 С, отделяют фракцию тироцитов центрифугированием, дважды отмывают указанной средой, разводят до конечной концентрации 150-350 тыс. клеток или их кластеров в 1 мл питательной средой, содержащей /12 ив соотношении 11 и 20 нативной сыворотки крови эмбрионов крупного рогатого скота, культивируют на питательной среде со стабилизированной человеческим альбумином тонкопластинчатой коллагеновой подложкой при 37 С в СО 2 инкубаторе, причем один раз в сутки проводят смену питательной среды, в которую,начиная со вторых суток, вносят тиротропин в количестве 70 мЕд/мл, а начиная с седьмых суток - соматостатин в количестве 5 Ед/мл, затем, начиная с двенадцатых суток, постепенно в течение трех суток снижают температуру культивирования до 24 С, затем в течение трех суток поднимают ее до 37 С, после чего культуру тироцитов отделяют от среды культивирования, отмывают и помещают в микропористый полиамидный биоконтейнер. Изобретение относится к области медицины, а именно к клеточным биотехнологиям и трансплантологии, и, в частности, к получению гормонально-активной ксеногенной культуры тироцитов с целью последующего трансплантационного лечения недостаточности щитовидной железы. Известны способы получения культивируемых тироцитов из аллогенной неонатальной щитовидной железы для лечения гипотиреоза путем их пересадки 1, 2. 13931 1 2010.12.30 Недостатками способов получения культивируемых тироцитов из аллогенной неонатальной щитовидной железы являются дефицит человеческого донорского материала,проблемы юридического, религиозного и морально-этического характера, трудоемкий протокол тестирования трансплантата на широкий спектр опасных инфекций (ВИЧ, гепатиты В, С, , герпес). Другой недостаток способов получения культивируемых аллогенных тироцитов из щитовидной железы - недостаточная степень очистки трансплантата от иммунокомпетентных антигенпредставляющих клеток (лейкоциты-пассажиры) и, как следствие, незначительные сроки функционирования пересаженной тиреоидной ткани. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения культивируемых ксеногенных тироцитов из щитовидной железы неонатальных поросят 3. Сущность известного способа заключается в том, что свежевыделенные щитовидные железы новорожденных поросят очищали от жировой и соединительной ткани и промывали холодной средой 199, содержащей антибиотики (100 ЕД пенициллина и 100 мкг стрептомицина на 1 мл среды). Затем железы разрезали на кусочки размером 1-2 мм 3 и подвергали последовательному воздействию по 30 мин на водяной бане при 37 С с постоянным перемешиванием вначале 0,125 раствором трипсина, а затем 0,1 раствором коллагеназы в среде 199. Надосадочную суспензию клеток собирали во флакон с холодной средой 199, содержащей 15 сыворотки крови крупного рогатого скота и антибиотики, а оставшуюся ткань снова подвергали воздействию коллагеназы. Данную процедуру повторяли 2-3 раза, после чего полученную суспензию клеток промывали несколько раз. Для освобождения клеток от фермента проводили центрифугирование суспензии при 1000 об/мин на протяжении 15 мин. Надосадочную жидкость сливали, а осадок клеток отфильтровывали через металлическое сито. Профильтрованные тироциты высевали в пробирки по 106 клеток в 1 мл среды культивирования. Культивирование проводили в атмосфере воздуха с 5 СО 2 в термостате при 37 С. Среду культивирования меняли в 1-й или на 2, 5, 8 и 11-й дни в зависимости от задач эксперимента. Для проведения гистологических исследований культуру тироцитов фиксировали в 10 -ном растворе нейтрального формалина, обезвоживали и окрашивали гематоксилином и эозином. Основными недостатками данного способа являются недостаточная очистка ткани щитовидной железы от балластных элементов (фибробласты, макрофаги, коллагеновые волокна) и быстрая утрата структурной стабильности, что, в свою очередь, снижает сроки функционирования трансплантата до 3-6 месяцев и положительный терапевтический эффект, а также его удорожание из-за необходимости тестирования тиреоидной ткани на ретровирусную инфекцию, носителем которой могут быть свиньи. Задачей изобретения является максимальная очистка ксеногенной ткани щитовидной железы от иммунокомпетентных и антигенпредставляющих структур с последующей макроинкапсуляцией донорского материала, что позволит обеспечить долговременную и эффективную жизнедеятельность пересаженных реципиенту тироцитов, а также исключение риска инфицирования реципиента опасными для жизни вирусами. Поставленная задача решается за счет того, что способ получения культуры ксеногенных тироцитов для лечения гипотиреоза у человека заключается в том, что выделяют щитовидную железу у новорожденного кролика, промывают ее в холодной питательной среде 199 с антибиотиками, механически измельчают, инкубируют в растворе, содержащем 1 коллагеназы и 0,125 трипсина, при периодическом встряхивании в течение 15 мин при температуре 27 С, затем в течение 15 мин постепенно повышают температуру до 37 С, отделяют фракцию тироцитов центрифугированием, дважды отмывают указанной средой, разводят до конечной концентрации 150-350 тыс. клеток или их кластеров в 1 мл питательной средой, содержащей /12 ив соотношении 11 и 20 нативной сыворотки крови эмбрионов крупного рогатого скота, культивируют на питательной среде со стабилизированной человеческим альбумином тонкопластинчатой коллагеновой подложкой при 37 С в СО 2-инкубаторе, причем один раз в сутки проводят 2 13931 1 2010.12.30 смену питательной среды, в которую, начиная со вторых суток, вносят тиротропин в количестве 70 мЕд/мл, а начиная с седьмых суток - соматостатин в количестве 5 Ед/мл, затем, начиная с двенадцатых суток, постепенно в течение трех суток снижают температуру культивирования до 24 С, затем в течение трех суток поднимают ее до 37 С, после чего культуру тироцитов отделяют от среды культивирования, отмывают и помещают в микропористый полиамидный биоконтейнер. Для решения поставленной задачи использовали свежевыделенные щитовидные железы неонатальных кроликов, которые очищали от жировой и соединительной ткани, переносили в стерильную чашку Петри, содержащую холодную среду 199 и раствор с антибиотиками (пенициллин - 100 Ед/мл, стрептомицин - 100 мкг/мл), разрезали на фрагменты размером 0,1-2 мм, которые заливали 1 раствором коллагеназы и 0,125 трипсина и инкубировали при температуре 27 С в течение 15 мин с последующим постепенным повышением температуры инкубации до 37 С в течение 15 мин при периодическом встряхивании (первая фракция). В том случае, если на дне оставались несепарированные фрагменты,их повторно сепарировали с помощью 1 раствора коллагеназы в течение 15 мин при температуре 37 С в среде 199 с содержанием 0,5 телячьей сыворотки. Следует отметить,что активная трипсинизация нативной тиреоидной ткани приводит к быстрому образованию монослоя тироцитов с недостаточной функциональной активностью. Использование комбинации коллагеназы/трипсина с созданием температурного градиента (10 С) и пролонгирование обработки ткани щитовидной железы со стабилизацией сывороткой позволяет получить мелкие кластеры с функциональным ответом на стимуляцию 50 мЕД тиротропина на уровне 80 , образующие полный монослой клеток на протяжении 5-10 суток. Надосадочные фракции тироцитов объединяли, полученную суспензию дважды отмывали средой 199 и доводили до конечной концентрации 150-350 тыс. клеток или их кластеров/мл с помощью соответствующего количества культуральной среды /12(11) с 20 нативной сывороткой крови эмбрионов крупного рогатого скота, и помещали в культуральные пластиковые флаконы с ростовой средой, которые затем помещали в 2-инкубатор (52) и инкубировали при 37 С. Культивирование клеточной биомассы проводили на культуральных флаконах с достаточной адгезивной способностью не менее уровня Се. Через сутки после прикрепления клеток производили смену ростовой среды, в дальнейшем - 1 раз в сутки. Прикрепленная фракция представляла собой многочисленные очаги культивируемых агрегатов клеток, вокруг которых формировались однослойные зоны роста эпителиальных клеток (тироцитов), тесно прилегающие друг к другу,неправильной формы. В качестве покрытия для культуральных флаконов использовали стабилизированную человеческим альбумином (5 фракция) тонкопластинчатую коллагеновую подложку, что позволило получить полный монослой тироцитов, представленный тесно прилегающими эпителиальными полигональными клетками, содержащими в цитоплазме мелкую зернистость к 5-12 суткам культивирования. Для поддержания оптимальной жизнедеятельности клеток, начиная со 2-го дня, в среду культивирования вносили тиротропин в концентрации 70 мЕд/мл, что приводило к достоверному увеличению количества тироксина в пробах. В то же время для замедления дестабилизации монослоя с 7-го дня культивирования стабилизировали культуру с помощью добавок соматостатина в дозе до 5 Ед/мл. Постепенный рост функциональной активности тироцитов сопровождался их кратерообразной десквамацией с формированием везикулярных структур - микрофолликулов, со 2-ой недели культивирования. Тироциты,выстилающие полость фолликулов, в большинстве случаев имели кубическую и призматическую форму, характерную для функционирующих фолликулов зрелой щитовидной железы. Нагрузочные тесты с тиротропином (100 мЕд/мл) на этой стадии указывали на возможность возрастания функциональной активности культуры на 300-500 по отношению к исходному на протяжении 2-3 недель. 13931 1 2010.12.30 Высокая метаболическая активность клеток щитовидной железы приводила к быстрой утилизации нутриентов, ростовых и поддерживающих факторов, что вызывало ускоренное старение культуры и препятствовало достижению оптимальных показателей функциональной активности. В качестве дополнительного способа стабилизации культуры начиная с 12 суток, культуру адаптировали к снижению температуры до 24 С в течение 3-х суток и столь же постепенным подъемом ее до 37 С за тот же период. Указанная манипуляция способствовала стабилизации микрофолликулов и тироксинпродуцирующей функции на протяжении 5 недель, в то время как другие методы (прототип) могут обеспечить стабильность функции тироцитов только в течение 2-3 недель. Наблюдения, проведенные до момента использования культуры для трансплантации, указывали на то, что культура во флаконах находилась в стационарной фазе роста, то есть при наблюдении в течение 3-х суток не происходило микроскопически визуализируемого изменения состава клеточных элементов. Отбор клеток из флаконов производили с помощью 0,125 раствора трипсина. Культуры освобождали от ростовой среды, отмывали -буфером и заливали 0,15 раствором трипсина с последующей инкубацией в течение 15 мин при 37 С, после чего клетки пипетировали и отмывали от реагента культуральной средой 1640 и 10 сывороткой крови эмбрионов крупного рогатого скота. Общий объем клеточной суспензии доводили до 2 мл с помощью центрифугирования и вводили в микропористый полиамидный контейнер (длина - 1,5-2 см, ширина - 4-5 мм, диаметр микропор, 1-2 мкм), предназначенный для трансплантации, с помощью стерильного шприца. Для герметизации капсулы использовали стандартный анатомический пинцет, бранши которого разогревали над огнем спиртовой горелки и затем охлаждали (контроль - электрический термопарный теромометр) до температуры 250 С. Затем края отверстия макрокапсулы сближали с некоторым усилием до полного сплавления. Контейнер находился в свежей культуральной среде 1640 до момента помещения в организм реципиента не более 20 мин. 1. Пример получения культивируемых ксеногенных тироцитов для лечения гипотиреоза. Использовали свежевыделенные щитовидные железы новорожденных кроликов, которых забивали гильотированием. Экстирпацию щитовидных желез осуществляли с соблюдением строгих правил асептики и антисептики (использовали ламинарный бокс,антисептики, кварцевание). Забитое животное тщательно отмывали несколько раз в теплой проточной воде и укладывали на спину. Кожу передней поверхности шеи и грудной клеткипросушивали тампоном и дважды обрабатывали 2,5 спиртовым раствором йода. Рассекали и отпрепаровывали изогнутыми ножницами кожу с подкожно-жировой клетчаткой, начиная от уровня подъязычной кости по средней линии вниз до уровня яремной вырезки. По бокам от трахеи находили обе щитовидные железы, которые выпрепаровывали из ложа, удаляли, очищали от капсулы, жировой и соединительной ткани с кровеносными сосудами и затем переносили в стерильную чашку Петри, содержащую холодный раствор 199 с антибиотиками при 7,2-7,4 (пенициллин - 100 Ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл), разрезали на фрагменты размером 0,1-2 мм, которые заливали 1 раствором коллагеназы и 0,125 трипсина (, Германия) и инкубировали при температуре 27 С в течение 15 мин с последующим постепенным повышением температуры инкубации до 37 С в течение 15 мин при периодическом встряхивании. Для освобождения клеток от фермента проводили центрифугирование суспензии при 1000 об/мин на протяжении 15 мин. Надосадочные фракции собирали во флакон емкостью 25 мл пипеткой Пастера, полученную суспензию дважды отмывали холодной средой 199 и доводили до конечной концентрации 150-350 тыс. клеток или их кластеров/мл с помощью соответствующего количества среды /12 (11) с 20 нативной сывороткой крупного рогатого скота, и помещали в культуральные пластиковые флаконы с ростовой средой, которые затем помещали в СО 2-инкубатор (5 СО 2) и инкубировали при 4 13931 1 2010.12.30 37 С. Через сутки после прикрепления клеток производили смену ростовой среды, в дальнейшем - 1 раз в сутки. В качестве покрытия для культуральных флаконов использовали стабилизированную человеческим альбумином (5 фракция) тонкопластинчатую коллагеновую подложку. Начиная со 2-го дня, в среду культивирования вносили тиротропин в концентрации 70 мЕд/мл. С 7-го дня культивирования стабилизировали культуру с помощью добавок соматостатина в дозе до 5 Ед/мл. Начиная с 12-х суток, культуру адаптировали к снижению температуры до 24 С в течение 3-х суток и столь же постепенным подъемом ее до 37 С за тот же период. Культуры освобождали от ростовой среды, отмывали -буфером и заливали раствором трипсина (0,15 ) с последующей инкубацией в течение 15 минут при 37 С, после чего клетки пипетировали и отмывали от реагента средой 1640 и 10 -ной сывороткой. Общий объем клеточной суспензии доводили до 2 мл с помощью центрифугирования (3 тыс. оборотов/мин) и вводили в микропористый полиамидный контейнер с помощью стерильного шприца. Пример использования полученной ксеногенной культуры тироцитов в клинической практике. Больная К., 39 лет, клинический диагноз послеоперационный гипотиреоз, среднетяжелое течение, клинико-гормональная и медикаментозная субкомпенсация. Заместительная терапия -тироксин 100 мкг 1 раз/сутки. Жалобы на общую слабость, сонливость,утомляемость, отеки лица и голеней. Операция ксенотрансплантация культуры тироцитов в глубокую бедренную артерию справа с аутовенозной пластикой. Иммуносупрессия не применялась. Период посттрансплантационного наблюдения - 24 месяца. Потребность в заместительной медикаментозной терапии -тироксин 25 мкг 1 раз/сутки. Отеки лица и голеней, сонливость, утомляемость не беспокоят. Уровень тиреогормонов, тиреотропного гормона, антител к тиреоглобулину в сыворотке крови в пределах нормы (Т 4 свободный - 14 пмоль/л, тиреотропный гормон 4,1 мМЕ/л, антитела к ТГ - 48 ед/мл). Сцинтиграфия ложа трансплантата через 6 месяцев после пересадки отмечено активное накопление радиофармпрепарата Тс 99. Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить функционально-активную и высокоочищенную культуру ксеногенных тироцитов из щитовидной железы новорожденных кроликов с последующей макроинкапсуляцией, что дает основание утверждать о возможности реализации предложенного способа в клинической практике с целью лечения тяжелых форм послеоперационного гипотиреоза. Источники информации 1. Блюмкин В.Н., Кирсанова Л.А., Скалецкий Н.Н. и др. Флотирующие культуры, получаемые из щитовидной железы плодов человека / // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1988. Т. 106. -11. - С. 600-602. 2.,., // . . . . . - 2003. - . 284. - . 1. . 168-176. 3. Шостак И.М., Тронько М.Д., Зурнаджи Ю.М., Пастер И.П. Изучение морфофункциональных свойств культивируемых тироци тов новорожденных поросят с целью определения возможности их применения для компенсации гипофункции щитовидной железы / Проблемы эндокринологии - 1992. -5. - С. 33-37. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5