Способ стимулирования корнеобразования у побега льна, полученного из каллусной культуры in vitro

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ КОРНЕОБРАЗОВАНИЯ У ПОБЕГА ЛЬНА, ПОЛУЧЕННОГО ИЗ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Гузенко Елена Витальевна Лемеш Валентина АлександровнаХотылева Любовь ВладимировнаКартель Николай АлександровичБаер Олег АлександровичЕмец Алла ИвановнаБлюм Ярослав Борисович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(56) ПОЛЯКОВ А.В. Биотехнология в селекции льна. - Тверь, 2000. - С. 90-93.2282352 1, 2006.2060646 1, 1996.14935 , 2006.6548300 1, 2003. ОРЛОВСКАЯ О.А. и др. Международная научная конференция От классических методов генетики и селекции к ДНК-технологиям Материалы конференции. - Минск, 2007. С. 57. ОРЛОВСКАЯ О.А. и др. Льноводство реалии и перспективы Сборник научных материалов. - Могилевская областная укрупненная типография имени Спиридона Соболя, 2008. - С. 123126. Получение растений-регенерантов льнадолгунца, устойчивых к фузариозному увяданию, методами(культура пыльников, клеточная селекция) Методические рекомендации. - Торжок,2008. - С. 4-9.(57) Способ стимулирования корнеобразования у побега льна, полученного из каллусной культуры, заключающийся в том, что срез побега помещают на границе раздела питательная среда/воздух, при этом в качестве питательной среды используют агаризованную безгормональную среду Мурасиге-Скуга, содержащую половинный набор макросолей и витаминов, 10 г/л сахарозы и 7 г/л агара, которой заполняют чашку Петри, с половины чашки Петри среду удаляют, прорезают в оставшейся части среды окошко, срезают побег с каллуса, протыкают побегом среду над окошком и продвигают его до соприкосновения среза со средой в нижней части окошка, после чего, сохраняя вертикальное положение побега, размещают чашку Петри на световой установке до образования корней. Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности к тем методам культивирования в условиях, где требуются укоренение полученных растенийрегенерантов и адаптация их к естественным условиям выращивания ( ). Изобрете 15623 1 2012.04.30 ние может успешно использоваться в технологиях на основе культивируемых тканей и клеток растений, а именно получение биологически активных веществ растительного происхождения, ускоренное микроклональное размножение, получение безвирусных растений, получение растений после отдаленной гибридизации, антерные культуры (гаплоиды, дигаплоиды), клеточный мутагенез и селекция, соматическая гибридизация,генетическая трансформация. Известно, что корнеобразование (ризогенез) и последующая адаптация к почвенным условиям являются наиболее трудновыполнимыми этапами в культуредля любого растительного материала и в высокой степени для льна, регенеранты которого характеризуются особенно низкой адаптационной способностью 1, 2. В используемых методах для получения корней у регенерантов льна меняют основной состав среды, уменьшая в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга 1, 3, 4, или заменяют ее средой Уайта 5, уменьшают количество сахаров до 0,5-1 и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин 6. В качестве стимулятора корнеобразования применяют -индолил-3-масляную кислоту, -индолил-уксусную кислоту 7 или -нафтил-уксусную кислоту 7, 8. Кроме этого, применяется затемнение нижней части сосуда, что также стимулирует корнеобразование 5. Аналогами заявляемого способа индукции корнеобразования могут считаться способы получения корней на жидких питательных средах. В данных способах для поддержания побегов используются подложки из парафиновых дисков, П-образных полосок фильтровальной бумаги, пенопластовых тонких пластинок либо пластинок из любого другого инертного пористого материала 5, 9. Полоски загибаются, концами вниз помещаются в пробирку так, чтобы образовавшаяся горизонтальная плоскость материала оказалась чуть выше уровня жидкой среды. Культивирование эксплантов происходит на подложке. Данные способы неудобны в исполнении, так как требуются многочисленные сложные манипуляции в стерильных условиях, к тому же микропобеги льна проблематично закрепить на подложке. Кроме того, использование парафиновых дисков может иметь отрицательное воздействие на корнеобразование и качество корневой системы из-за ухудшения аэрации микропобегов 9. Наиболее близким к заявляемому является метод, в котором используется безгормональная среда Мурасига и Скуга, содержащая половинный набор макросолей и витаминов, агар (7 г/л) и сахарозу (10 г/л) 1. Несмотря на варьирование состава сред, способ получения корней у регенерированных побегов льна во всех методиках одинаков побеги длиной 2-2,5 см отделяют от каллуса и заглубляют в выбранной среде так, чтобы побег сохранял вертикальное положение. В течение довольно длительного промежутка времени (1-2 месяца) формируются корни. Данный способ имеет существенные недостатки. При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах происходит постепенное накопление веществ токсического действия (фенольные соединения), что приводит к формированию растений с измененной морфологией 10. Возможно накопление этилена, вызывающего эпинастию и хлороз 10, 11. Вместе с тем наблюдаются такие нежелательные эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование верифицированных (оводненных) побегов и, как следствие, уменьшение способности растений к укоренению. При заглублении побегов в среду культивирования уменьшается аэрация нижней части стебля растениярегенеранта. В таких условиях образование корней затруднено, а образовавшиеся корни обладают сниженной биосинтетической активностью, замедляется поглощение воды и солей, что вызывает ослабление роста побегов 12. В связи с этим задача заявляемого способа состоит в создании определенных условий культивирования, стимулирующих ризогенез, у растений-регенерантов. 15623 1 2012.04.30 Для решения поставленной задачи разработана методика стимулирования корнеобразования. Сущность заявленного способа состоит в том, что при переносе на среду для ризогенеза побеги льна не заглубляются в питательную среду, а культивируются на границе питательная среда/воздух. Известно, что у молодых тканей с высоким содержанием физиологически активного материала (в данном случае срез стебля регенерированного побега) интенсивность клеточного дыхания выше, чем у зрелой ткани. Также известно, что образование вторичных корней происходит из клеток камбия. Заявляемый способ основан на улучшении аэрации камбиальной зоны стебля, что приводит к увеличению активности клеток этой зоны и,следовательно, способствует образованию корней. Для заявляемого способа используется безгормональная среда Мурасига и Скуга, содержащая половинный набор макросолей и витаминов, агар (7 г/л), сахарозу (10 г/л). Далее следует специальная подготовка чашек Петри, заполненных средой указанного состава. Подготовка включает следующие этапы 1) заливают 25-30 мл среды в чашку Петри диаметром 90 мм 2) отделяют с помощью скальпеля и удаляют половину среды (фиг. 1) 3) отступив от верхней границы оставшейся половины среды 5 мм, прорезают окошко практически на всю ширину чашки (примерный размер 580 мм) (фиг. 2) 4) побеги отделяют от каллуса. Растение держат пинцетом, подносят к мостику из среды (фиг. 3) 5) протыкают мостик стебельком и продвигают до тех пор, пока срез стебля растения слегка не коснется поверхности той части среды, которая образует нижнюю часть окошка. Стрелкой указано направление действия (фиг. 4) 6) чашки Петри с помещенными в них побегами размещают на световых установках вертикально. При реализации проектов с применением биотехнологических методов на культуре льна в основном используются сорта льна масличного 13, 14, 15. Они обладают более высокой регенерационной способностью по сравнению с сортами льна-долгунца 16. При разработке заявляемого способа мы использовали генотипы сортов и льна масличного, и льна-долгунца. Индукция ризогенеза по заявляемому методу позволяет одинаково успешно получать функциональные корни у побегов льна обоих типов. Наблюдаемое интенсивное развитие корневой системы (фиг. 5) способствует быстрому установлению оптимального эндогенного баланса гормонов, что позволяет растениям легко адаптироваться к условиям выращивания(фиг. 6). В результате проведенных нами наблюдений установлено, что индукция ризогенеза заявляемым способом сокращает сроки образования корней до 10-20 дней по сравнению с 30-60 днями, если пользоваться общепринятой методикой повышает эффективность ризогенеза до 80 по сравнению с 10-20 , если пользоваться общепринятой методикой позволяет получить хорошо развитую корневую систему, что облегчает адаптацию побегов к условиямпозволяет получать корни у генотипов льна с различной регенерационной способностью. Источники информации 1. Поляков А.В. Биотехнология в селекции льна. - Тверь, 2000. - 150 с. 2..,В..//. 15623 1 2012.04.30 4..,.,.,.,.(.)// . . . 94. -4. - 2007. - . 120-128. 5. Основы биотехнологии растений. Культура клеток и тканей Учебное пособие / И.К. Сорокина, Н.И. Старичкова, Т.Б. Решетникова, Н.А. Гринь. - СГУ им. Н.Г.Чернышевского,2002. - 45 с. 6..//. . . -35456 - 465. -- , 1999. 7. - .,.,(.)// . 2002. - . 92-101. 8.,,,,,.// .. . 1 (1). - 2004. - . 1-10. 9. Пронина И.Н. Оптимизация процесса ризогенеза подвоев и сортов яблони и грушиАвтореферат канд. дисс. - Мичуринск, 2008. - 23 с. 10. Кузьмина Н.А. Основы биотехнологии // ///, 2005. 11. Бабикова А.В., Горпенченко Т.Ю., Журавлев Ю.Н. Растение как объект биотехнологии // КОМАРОВСКИЕ ЧТЕНИЯ. - Вып. . - 2007. - С. 184-211. 12. Крамер П.Д., Козловский Т.Т. // Физиология древесных растений. - 1983. - 464 с. 13. Баер О.А., Баер Г.Я., Емец А.И., Блюм Я.Б. Введение в культуруи регенерационная способность сортов льна-долгунца с различной устойчивостью к полеганию // Физ. и биох. культ. растений. - 2004. - Т. 36. -1. - С. 48-54. 14. Поляков А.В., Чикризова О.Ф., Каляева М.А., Захарченко Н.С., Балохина Н.В.,Бурьянов Я.И. Трансформация растений льна-долгунца // Физиол. растений. - 1998. Т. 45. -6. - С. 882-887. 15.,,,,,.// .. . 1 (1). - 2004. - . 1-10. 16.,,.//12-13 , 2008, ,Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6