Культивирование Lawsonia intracellularis и вакцины против Lawsonia intracellularis

11. Способ культивирования бактерий Ь. 1 птгасе 11 и 1 аг 15, отличающийся тем, что включает заражение культуральных клеток инокулятом, содержащим бактерии Ь. 1 птгасе 11 и 1 аттз, инкубацию инфицированных бактериями клеток при температуре от примерно 36 С до примерно 38 С, концентрации кислорода от примерно О до примерно 8 при перемешивании инфицированных бактериями клеток таким образом, чтобы культивировать бактерии Ь. 1 птгасе 11 и 1 аг 15 при поддержании инфицированных клеток в суспензии.12. Способ получения аттенуированного штамма 1 йптгасе 11 и 1 агтв, отличающийся тем,что включает получение культуральньтх клеток, инфицированных бактериями Т 1 п 1 гасе 11 ц 1 атйз, инкубацию инфицированных клеток при концентрации кислорода от примерно 0 до примерно 18 , перемешивание инфицированных клеток таким образом, чтобы культивировать бактерии при поддержании инфицированных клеток в суспензии, нассирование, по меньшей мере, части культивированных бактерий, сбор, по меньшей мере, части культивированных бактерий и селекцию аттенуированного штамма.13. Способ определения наличия антител, специфически реагирующих с бактериями 1,. йтгасептнатйз, отличающийся тем, что включает получение культуральньтх клеток, инфицированных бактериями Ь. 1 нтгаее 11 и 1 аг 15 инкубацию инфицированных бактериями клеток при концентрации кислорода от примерно 0 до примерно 18 , перемешивание инфицированных бактериями клеток таким образом, чтобы культивировать бактерии Г 1 гпгасе 11 иаг 15 при поддержании инфицированных клеток в суспензии, сбор, по меньшей мере, части культивированных бактерий Ь. 1 итгасе 11 и 1 аг 15, получение биологического образца от животного, контакта биологического образца с собранными бактериями Ь. 111 вгасе 11 и 1 аг 15 или компонентом, полученном из них, в условиях, при которых антитело реагирует с бактериями Ь. йпттасешпатйз или с компонентом, и установление факта взаимодействия антитела с антигеном при наличии в биологическом образце антител к бактериям Ь. 1 птгасе 11 и 1 аг 15.14. Вакцина для индукции у животного иммунного ответа к бактериям Ь. йптгасеншагйа, отличающаяся тем, что включает иммунологически эффективное количество аттенуированного штамма 1 1 тгасе 11 и 1 аг 15 АТСС 55783 или штамма убитых бактерий 14. 1 ПГЕ 1 СС 11 Ц 1 Е 1 Г 1 З, выбранного из группы штаммов АТСС 55672, ЫСТС 12656 и ЫСТС 12657, в фармацевтически приемлемом носителе.15. Вакцина по п. 14, отличающаяся тем, что включает атгенуированный штамм, полученный способом по п. 12.16. Вакцина по п. 14, отличающаяся тем, что включает убитые бактерии 1,. йптгасеПи 1 аг 15, Полученные способом по п. 1.17. Вакцина по п. 14, отличающаяся тем, что включает бактерии Ь. Ептгасептнатйа, выделенные из кулЬтуралы-тьтх клеток, зараженных с помощью кишечного гомогената инфицированного Ь. 1 птгасе 11 ц 1 а 1 т 5 нсивоттюго.18. Способ индукции иммунного ответа у экивотных на бактерии Ь. 1 пЪгасе 11 ЦПаг 15, отличающийся тем, что включает введение животному иммунологически эффективного количества вакцины по п. 14.19. Аттенуированньтй штамм бактерий Ь. 1 пггасе 11 и 1 аг 1 з АТСС 55783 для индукции у животного иммунного ответа, полученный способом по п. 12.Настоящее изобретение направлено на создание вакцины против бактерий Ьашзопа иггасг 1 ли 1 аг 19 способы защиты от них и диагностику инфекций,вызываемых Ьашзопа гтгаседийзгв. Продукты и способы по изобретению частично достижимы в результате усовершенствованного способа, который разработан Для крупномасштабного культивирования бактерий Ьашзопа Ешгаседидтсгз.Бактерии Ьашзопа ЕпсгаСгьЧиЕагш являются причинным агентом пролиферативиой энтеронатии свиней (ПЭС) и Действует практически на все животные организмы, включая человека, кроликов, хорьков, хомяков, лис,лошадей и других животных, таких различных, как страусы и эму.Бактерии Ьашзопш ЕпггисеПиЕагЕЗ являются особенно значительной причиной потерь в свиных стадах. Оценки распространенности и заболеваемости ПЭС в США достигали 20 процентов свиного стада с Номинальными потерями в 20 миллионов долларов ежегодно.Характерным признаком ПЭС является обнаружение интрацитопдтазматических не связанных с мембраной изогнутых палочковых бактерий в энтероцитах поврежденных областей кишечника. Бактерии,ассоциированные с ПЭС, были отнесены к СатрдМОЬасггг-подобным организмам. З. МсОны И др Чет. Ратно 1. т. 26, 260-64 (1989). Впоследствии причинные бактерии были идентифицированы как новый таксономический род и вид, общеупотрсбительно отнесенный к Едва зутддопг (15) Епггасепиаггз. С. СеЬЬагК и др., 1 птегнаиола 1 1. об Зувтешйс Вастегйонэау, т. 43, По 3, 533-38 (1993). Позднее эти новые бактерии получили таксономическое название Ьашвопа (Ь) Епггасеигаггя. З. Мс 0 т 15 т и др., Ьнетайопа 1. оГ Зузтетйс Васгепыону, т. 45, На 4,820-25 (1995). Эти три названия были использованы равнозначно для обозначения того же организма, что и идентифицированный и описанный в дальнейшем здесь. Заявитель стремился использовать таксономическое название, Ь. пггаседдийхггз, в ходе обсуждения настоящего изобретения.Ь. Епггаседидагз - это облигатнан внутриклеточная бактерия, которая не может культивироваться нормальными бактериологическими методами наобычных бесклеточньтх средах и, как считалось, для роста им необходимыприкрепленные эпителиальные клетки. 5. МсОг 151 и др, пгесттоп апс 1 1 тшип 11 у, т. 61, Не 10, 4286-92 (1993) и О. Ьашзоп и др., 1. о 1 С 11 п 1 са 1 М 1 сгоЬ 1 о 1 о 3 у, т. 31, Не 5,1136-42 (1993) обсуждают культивирование 1 пггаседиагв с использованием монослоев клеток кишечного эпителия крысы 1 ЕС-18 в обычных сосудах для культур тканей. Кроме того, Н. 511115, Епгесгйоп ада 1 ттцп 11 у, т. 59, Ля 9, 3227-36(1991) обсуждает использование монослоев клеток кишечника человеческого эмбриона птезипе 407 и монослоев клеток аденокарциномы ободочной кишки морской свинки в обычных сосудах для культур тканей. Эти прежние методы культивирования трудоемки и не пригодны для масштабирования.Современному пониманию инфекции, вызываемой 1 Ептгаседигагэ,лечению и эффективному контролю заболевания серьезно препятствовали изощренные требования к п игго культурам, Ь ЕпггасеЕЕиЕаг-з. В настоящее время необходим улучшенный способ культивирования Ь, Епггаседгиагтз. Необходимы также вакцины против Ь. пггаседдидагз и эффективные средства диагностики инфекции, вызываемой Е. пггаседдидагтз.Одним объектом изобретения является обеспечение вакцин против бактерий 1, тгасгдъдагтз.Другим объектом изобретения является обеспечение способов определения наличия антител к Ь. Епггаседиаггв в биологических образцах.Дальнейшим объектом является обеспечение улучшенного способа культивирования Е. Епггаседийщгз, позволяющего проводить его в больших масштабах с целью получения вакцин и диагностических агентов.Для достижения этих и других объектов и в соответствии с задачей изобретения, как осуществлено и подробно здесь описано, настоящее изобретение обеспечивает способ культивирования Ь. пггаскядигагз и круиномасштабньвс поставок образующихся при этом бактерий. В соответствии со способом бактерии 1,ЕпггасеНиАТагЕз инкубируют в культуральньтх клетках при концентрации кислорода менее примерно 18 и поддерживают культуральньте клетки в виде суспензии.В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения обеспечивается способ культивирования бактерий Ь. пггасеЕЕиЕагЕз посредством инокуляции (заражения) культуральных клеток (монослоя клеток Нер-2 МсСоуз или 1 ЕС-18 со слиянием около 30 Процентов) инокулятом, содержащим бактерии 1. Епггасеигагз, для того, чтобы инфицировать клетки бактериями. Затем инфицированные клетки инкубируют при температуре от примерно 3 бС допримерно 38 С концентрации кислорода от примерно 0 до примерно 8 до техпор, пока не произойдет слияние клеток. Затем инфицированные клетки и ростовая среда помещаются в ферментер, биореактор вращающийся сосуд или в какой-либо другой сосуд, пригодный для поддержания клеток в суспензии. Инфицированные клетки инкубируют при перемешивании таким образом, чтобы культивировать бактерии 1,. ЕпКгас-еЕЕиЕагЫа при поддержании инфицированных клеток в суспензии. Затем часть культивированных бактерий Ь. гтгасеггигагдз иассируется в свежие культуральные клетки для того, чтобы увеличить образование бактерий Е. пггасеЦийггв.Изобретение обеспечивает вакцины против 1 Етгаседиаггв и способы получения вакцин против 1. Епггаседидагз. Авирулентиые бактерии 1,. пггасгдигагз получаются пассированием культивированных бактерий Ь. тггаселидаггз достаточное число раз и отбором аттенуированного штамма или путем воздействия на культивированные бактерии химических способов аттенуации. Убитые вакцины Ь. тгасегдидаггз также получаются с использованием методов культивирования данного изобретения. В соответствии с особо предпочтительным вариантом осуществления изобретения бактерии непрерывно культивируют в течение, по крайней мере, около 6 и до 8 месяцев при пассированин, по крайней мере, от около 7 и до 12 раз с целью получения аттенуированного штамма для использования его в качестве вакцины. Затем аттенуированньте бактерии смешивают с фармацевтически приемлемым носителем и в эффективном количестве вводят животному для того, чтобы получить иммунный ответ. Заявитель сдал на хранение в Американскую Коллекцию Типовых Культур (АКТК) предпочтительный в настоящее времяИзобретение обеспечивает также способ определения наличия антител,которые реагируют специфически с бактериями Ь. тгаседидагэ в биологическом образце, путем выращивания, по меньшей мере, части культивированных бактерий Ь. тггаседидагз, заражения биологического образца от животного выращенными бактериями Ь. тггасеииагз или их компонентом в условиях, при которых антитело, присутствующее в биологическом образце, реагирует с Ь. ттгаседгийхггз или с компонентом, и определения того, происходит ли реакция антитела с антигеном.Дополнительные признаки и преимущества изобретения будут упомянуты далее в нижеследующем описании и станут очевидными при прочтении описанияИЛИ МОГУТ бЫТЬ ПОНЯТЬ при ПРЗКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВЗНИИ ИЗОбРСТСНИЯ.