Способ получения вакцины против пастереллеза или сальмонеллеза животных

61 39/102, 12 1/20 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ПАСТЕРЕЛЛЕЗА ИЛИ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ(73) Патентообладатели Шимко Владимир Владимирович, Скибо Вадим Никодимович(57) Способ получения вакцины против пастереллеза или сальмонеллеза животных, включающий наращивание микробной массы путем посева культуры микроорганизмов на питательную среду, содержащую мясопептонный агар на переваре Хоттингера, инактивацию микробной массы и сорбирование адъювантом, отличающийся тем, что в качестве культуры микроорганизмов для наращивания микробной массы используют эпизоотические свежевыделенные из патологического материала культуры пастерелл или сальмонелл, прошедшие 3-5 первичных пассажей, которые выделяют путем бактериологического посева из патологического материала на питательную среду на основе мясопептонного бульона на переваре Хоттингера,содержащую 0,25-0,3 мас.дрожжевого экстракта, причем при выделении для получения чистой культуры на 2-3 пассаже используют висмут-сульфит агар, а для наращивания микробной массы используют питательную среду на основе мясопептонного агара на переваре Хоттингера, содержащую 0,1-0,2 мас.дрожжевого экстракта.(56) 1.1667868, МПК А 61 К 39/00, 1991. 2. Краткий определитель бактерий Берги / Под ред. Хоулта. - М., 1980. 3. Методические указания по диагностике пастереллезов сельскохозяйственных животных, 1987. 4. Методические указания по бактериологической диагностике сальмонеллезов животных, 1971. Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для получения вакцины для профилактики и лечения респираторных заболеваний животных, преимущественно против пастереллеза и сальмонеллеза крупного рогатого скота и свиней. Известен способ получения вакцины против пастереллеза животных, включающий наращивание микробной массы путем посева производственной культуры микроорганизмов на питательную среду, содержащую мясопептонный бульон на переваре Хоттингера, инактивацию микробной массы и сорбирование адъювантом 1. Однако этот способ не обеспечивает получение вакцины, эффективной против пастереллеза, вследствие того, что производственные культуры в процессе пассажей теряют антигенные и иммуногенные свойства. Задачей изобретения является обеспечение возможности получения вакцины с достаточными антигенными и иммуногенными свойствами. Поставленная задача достигается тем, что в способе получения вакцины против пастереллеза или сальмонеллеза животных, включающем наращивание микробной массы путем посева культуры микроорганизмов на питательную среду, содержащую мясопептонный агар на переваре Хоттингера, инактивацию микробной массы и сорбирование адъювантом, в качестве культуры микроорганизмов для наращивания микробной массы используют эпизоотические свежевыделенные из патологического материала культуры пастерелл и сальмонелл, прошедшие 3-5 пассажей, которые выделяют путем бактериологического посева из патологического материала на питательную среду на основе мясопептонного бульона на переваре Хоттингера,содержащую 0,25-0,3 мас.дрожжевого экстракта, с использованием на 2-3 пассаже висмут-сульфит агара, а 3203 1 для наращивания микробной массы используют питательную среду на основе мясопептонного агара на переваре Хоттингера, содержащую 0,1-0,2 мас.дрожжевого экстракта. Предложенный способ осуществляют следующим образом. В качестве патматериала для выделения пастерелл и сальмонелл использовали легкие, бронхиальные лимфоузлы, сердце, почки, печень, селезенку и костный мозг от павших или вынужденно убитых животных из неблагополучных по пастереллезу или сальмонеллезу хозяйств. Для выделения пастерелл или сальмонелл производят бактериологические посевы из патологического материала на питательную среду на основе мясопептонного бульона (МПБ) на переваре Хоттингера, который содержит 0,25-0,3 мас.дрожжевого экстракта. Питательную среду готовят следующим образом. Приготавливают МПБ на переваре Хоттингера. Один килограмм мяса, очищенного от жира и сухожилий, нарезают кусками и небольшими порциями опускают в кастрюлю с двойным количеством (по отношению к мясу) кипящей воды. Кипятят в течение 1520 минут, затем вынимают шумовкой и пропускают через мясорубку. Устанавливают рН бульона 8,0. Затем опускают фарш в бульон, охлажденный до 40 С. Добавляют поджелудочную железу, пропущенную через мясорубку, в количестве 10 к взятой жидкости (на 1 л жидкости 100 г железы) или сухой панкреатин в количестве 0,5 , размешивают, доводят рН до 7,8-8,0. Такое подщелачивание повторяют через 30 минут. Добавляют 2-3 хлороформа, бутыль несколько раз встряхивают и оставляют на 10-14 дней при комнатной температуре. Первые 3-4 дня ежедневно проверяют реакцию среды. По окончании переваривания раствор фильтруют, добавляют дрожжевой экстракт из расчета 0,25-0,3 к объему бульона и стерилизуют. Для получения чистой культуры пастерелл или сальмонелл предварительно выделенные культуры в отдельности высевают на висмут-сульфит агар в чашках Петри. Посевы делают штрихами. Дифференциацию пастерелл и сальмонелл проводили согласно 2, 3, 4. Патогенность выделенных культур пастерелл и сальмонелл изучали на белых мышах массой 18-20 г. Мышей заражали бульонной культурой подкожно (0,2 мл) и в брюшную полость (0,2 мл). За зараженными животными наблюдали в течение 10 дней. Иммуногенные свойства выделенных пастерелл и сальмонелл изучали на белых мышах в лабораторных условиях. Для накопления микробной массы свежевыделенные и идентифицированные патогенные для белых мышей культуры пастерелл и сальмонелл (в отдельности) пересевают на МПБ на переваре Хоттингера в пробирках по количеству матр и инкубируют в термостате при температуре 36,5-37,5 С в течение 18 часов. После инкубации бульонную культуру засевают на МПА на переваре Хоттингера в матры емкостью 1,5 литра из расчета одна пробирка бульонной культуры на матру. Мясопептонный агар готовят на переваре Хоттингера по общепринятой методике с добавлением 0,1-0,2 дрожжевого экстракта. Разливают расплавленный агар в биологичекие флаконы (матры) емкостью 1,5 литра из расчета 260 мл на флакон. Культуру на МПА в матрах выращивают в термостате при температуре 36,5-37,5 С в течение 18 часов. Затем культуру вышеуказанных микроорганизмов смывают с агара 50 мл физиологического раствора на одну матру. Смытую культуру пастерелл и сальмонелл (каждую культуру раздельно) сливают со всех флаконов в одну стерильную емкость, перемешивают и определяют концентрацию бактерий по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Контроль чистоты культур проводят микроскопически. Культуры должны быть однородными, не содержать посторонней микрофлоры. После определения оптической плотности концентрацию бактерий доводят физиологическим раствором до 3,6-3,8 млрд. микробных тел в одном мл. Приготовленные таким образом культуры микроорганизмов смешивают в указанном в таблице 1 соотношении. В каждый из указанных в таблице 1 вариант смеси добавляют для инактивации формалин. Полноту инактивации определяют путем посева на МПБ и МПА в соответствии с ГОСТ 28085-89 Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности. Затем к каждой из полученной формалинизированной суспензии микроорганизмов добавляют в качестве адъюванта алюминия гидрат окиси колоидный (гидроксал) (ГОСТ 18287-81 в количестве 0,3 в виде 6 ного раствора. Получают варианты вакцин с содержанием компонентов, указанных в таблице 2. Полученные варианты вакцин проверяют на стерильность, безвредность и иммуногенность. Вакцины считаются активными, если они имеют коэффициент иммунологической эффективности не ниже 80 . Полученная вакцина предназначена для профилактики и ликвидации пневмоний животных, преимущественно пастереллезной и сальмонеллезной этиологии молодняка крупного рогатого скота и свиней, представляет собой прозрачную слегка опалесцирующую жидкость с хорошо разбивающимся при встряхивании белым осадком. Вакцину применяют внутримышечно с соблюдением правил асептики и антисептики крупному рогатому скоту в дозе 4 мл, независимо от возраста, свиньям - 3 мл. 3203 1 Противоэпизоотическую эффективность вакцины оценивали в комиссионных опытах непосредственно в хозяйствах. В межколхозном предприятии Боровица Ивановского района Брестской области опыты по изучению противоэпизоотической эффективности ставили в двух повторностях. В первом случае в опытной группе было 620 голов поросят (бокс 16), в контрольной группе - 619 (бокс 2). Группы животных были подобраны по принципу аналогов. Поросят опытной группы вакцинировали двукратно с интервалом 30 дней в дозе 3 мл внутримышечно. Схемы плановых специфических профилактических мероприятий опытной контрольной групп не менялись. В ходе опыта за животными велся строгий ветеринарный и зоотехнический учет. После введения вакцины у животных пирогенной, анафилаксической, местной и токсической реакции не отмечено. Окончательно учет результатов опытов проводили при передаче групп животных на откорм. В ходе опыта установлено, что в опытной группе пало 134 гол. (21,6 ), в контрольной - 202 (33 ), вынужденно убито соответственно 3 и 5 голов, санитарный брак отмечен только в контрольной группе - 16 гол. Сохранность в опытной группе составила 77,01 , в контрольной - 63,56 . Таким образом, из опытной группы было передано для откорма на 99 голов свиней больше, чем в контрольной группе. Во второй серии опытов иммунизировали 619 голов поросят (бокс 15), контрольная группа составляла 642 голов (бокс 6). В данном случае сохранность поросят составила 85,5 , в контрольной - 78,2 . Проверку противоэпизоотической эффективности вакцины проверяли также в комиссионных опытах на телятах в Ждановичском тепличном комбинате Минского района и в хозяйствах Копыльского района (колхоз Тимковичи). В Ждановичском тепличном комбинате, например, в мае 1995 г. на фермах Кунцевщина и Тарасово была отмечена вспышка заболевания телят в группах доращивания, сопровождающаяся пневмониями и диареей. Заболевание сопровождалось падежом и непроизводительным выбытием молодняка. Клинически заболело 11 голов, из них прирезано 10 голов и один теленок пал. Лечение оказалось малоэффективным. При бактериологическом исследовании патматериала были выделены патогенные для белых мышей пастереллы и сальмонеллы. Из выделенных культур была приготовлена экспериментальная серия вакцины, которой было привито двукратно 189 голов телят. Спустя 7-10 дней заболевание телят в данных группах прекратилось. Таким образом, результаты опытов показывают, что вакцина, приготовленная предлагаемым способом,безвредна, не вызывает анафилаксической, пирогенной, токсической и местной реакции, а также обладает выраженным противоэпизоотическим эффектом и может быть использована для повышения сохранности молодняка крупного рогатого скота и свиней. Таблица 1 Содержание суспензий культур микроорганизмов в вакцине Вид микроорганизма Состав вариантов приготовления вакцин Название 1 Формалинизированная суспензия свежевыделенных из неблагополучных по пневмоэнтеритам хозяйств патогенных культур микроорганизмов видов,3,6-4,0 млрд. микробных тел/млАлюминия гидрат окиси колоидный 6 -ный Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66. 3