Гелеобразующие смешанные фосфорнокислые и карбаматные эфиры декстрана и способ их получения

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ГЕЛЕОБРАЗУЮЩИЕ СМЕШАННЫЕ ФОСФОРНОКИСЛЫЕ И КАРБАМАТНЫЕ ЭФИРЫ ДЕКСТРАНА И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ(71) Заявители Учреждение Белорусского государственного университета Научно-исследовательский институт физико-химических проблем Государственное научное учреждение Институт общей и неорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Юркштович Татьяна Лукинична Голуб Наталья Васильевна Юркштович Николай Константинович Костерова Раиса Ивановна Алиновская Валентина Александровна Бычковский Павел Михайлович Беляев Сергей Александрович(73) Патентообладатели Учреждение Белорусского государственного университета Научно-исследовательский институт физико-химических проблем Государственное научное учреждение Институт общей и неорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) 1. Гелеобразующие смешанные эфиры декстрана, содержащие фосфорнокислые и карбаматные группы, общей формулы 67231(2)22,где- степень замещения по фосфорнокислым группам,12 и имеет значение от 0,47 до 1,09 1 - степень замещения по моноэфирам и имеет значение от 0,01 до 0,48- число фосфатов в моноэфирах и имеет значение от 1 до 2 2 - степень замещения по диэфирам и имеет значение от 0,01 до 1,08- степень замещения по карбаматным группам и имеет значение от 0,39 до 1,23- степень полимеризации, 201000,обладающие антипролиферативной активностью по отношению к опухолевым клеткам. 2. Способ получения смешанных эфиров декстрана по п. 1, при котором исходный декстран сушат, затем осуществляют этерификацию ортофосфорной кислотой в расплаве мочевины при мольном соотношении -ангидроглюкопиранозное звено декстранаортофосфорная кислотамочевина, равном 1(0,6-1,0)4,0, температуре 110-140 С и остаточном давлении 0,05-0,27 атм, охлаждают до комнатной температуры, добавляют воду до пастообразного состояния реакционной массы, затем обрабатывают 0,75 М раствором хлорида натрия в 70 -ном растворе этилового спирта,которого доведен гид 16349 1 2012.10.30 роксидом натрия до значения 11,0-12,0, полученный осадок промывают 70 -ным раствором этилового спирта и сушат. Изобретение относится к медицине, в частности к высокомолекулярным соединениям,конкретно эфирам декстрана, содержащим фосфорнокислые и карбаматные группы, обладающим биологической активностью и предназначенным для создания пролонгированных лекарственных средств. Декстран - полисахарид, состоящий из глюкопиранозных звеньев, связанных между собой преимущественно -1,6 связью, а также, в значительно меньшей степени, -1,2 и -1,3 связями. Декстран растворим в воде, обладает биосовместимостью и способностью к биодеградации в тканях живого организма без выделения токсичных веществ. Известно, что введение в состав декстрана функциональных групп определенного типа (сульфатных,карбоксильных, альдегидных, фосфорнокислых и др.) сообщает ему набор дополнительных физико-химических и медико-биологических свойств 1-9. Например 1, сульфат декстрана обладает антикоагулянтной активностью, низкой токсичностью и находит применение в клинике. Кроме того, известно 2, что сульфаты декстрана оказывают антипролиферативное действие по отношению к различным вирусам, а также ВИЧ-инфекции. В отличие от сульфатов декстрана, синтезу и изучению медико-биологических свойств фосфатов декстрана посвящено сравнительно небольшое количество исследований 3, 6-8. В работе 3 описывается метод получения низкозамещенных фосфатов декстрана путем этерификации раствором полифосфорной кислоты в формамиде и установлено, что фосфат декстрана (содержание фосфора - 1,7 ) обладает иммуномодулирующей активностью и способен индуцировать иммуномодулирующее действие интерферонов (-10 и -). Фосфаты декстрана - это производные декстрана, в которых путем этерификации часть гидроксильных групп полисахарида замещена фосфорнокислыми группами, в основном с образованием моно- и диэфиров. Образование диэфиров предопределяет сшивку макромолекул декстрана, т.е. возможность получения его не только в виде растворов, но и в виде гидрогелей. Получение гидрогелей, способных поглощать значительное количество воды (или другой жидкости) и удерживать ее без растворения, является одним из перспективных и интенсивно развивающихся направлений в химии высокомолекулярных соединений. Гидрогели используются при разработке композиций для изготовления мягких контактных линз, лекарственных форм с пролонгированным высвобождением активного вещества,трансдермальных терапевтических систем, сорбентов, материалов для изготовления эндопротезов и т.д. Причиной широкого и разнообразного применения гидрогелей является их уникальная пористая структура, обеспечивающая высокую скорость набухания в воде,высокую проницаемость для низко- и высокомолекулярных соединений, а также хорошую биосовместимость 10, 11. Соотношение моно- и дизамещенных фосфатов декстрана зависит от вида и состава этерифицирующей смеси, условий проведения реакции фосфорилирования. В литературе описаны разнообразные методы этерификации декстрана. Известно 3, 7-9, что для получения высокозамещенных фосфатов декстрана (степень замещения гидроксильных групп фосфорнокислыми в одном глюкопиранозном звене равна или превышает 0,8) используются, как правило, высокотоксичные и агрессивные реагенты, такие как хлорокись фосфора, оксид фосфора . Применение менее агрессивных реагентов, например фосфатов натрия или калия, полифосфатов, ортофосфорной кислоты и др., способствует получению низкозамещенных фосфатов декстрана. Низкозамещенные фосфаты декстрана, полученные вышеуказанными методами, являются водорастворимыми соединениями. Прототипом изобретения являются смешанные эфиры крахмала в виде гидрогелей,содержащие фосфорнокислые и карбаматные группы, способ их получения 12. Полученные смешанные эфиры крахмала могут быть использованы в качестве сорбентов для 2 16349 1 2012.10.30 очистки воды от полизарядных катионов металлов, как загущающие агенты. Включение карбаматных групп в структуру фосфата полисахарида способствует возникновению дополнительных межмолекулярных взаимодействий (водородные связи, химические сшивки) и, как следствие, получению продуктов реакции этерификации в виде гидрогелей в широком интервале изменения степени замещения по фосфорнокислым группам. Известный процесс фосфорилирования крахмала проводят ортофосфорной кислотой в расплаве мочевины при температуре 110-140 С под вакуумом (0,01-0,13 атм) в течение 1-3 часов. После охлаждения к реакционной массе добавляют дистиллированную воду для набухания полученных гидрогелей, промывают 3 раза раствором метилового спирта (80 -ный раствор), высушивают под вакуумом при 50 С в течение 3 часов. Указанный способ не может быть использован для получения гидрогелей фосфатов декстрана по следующим причинам интенсивно протекающий процесс деструкции декстрана приводит к получению фосфорнокислых эфиров темного цвета исключительно в виде вязких растворов непригодность данного способа этерификации для получения гидрогелей полисахаридов, имеющих низкую степень полимеризации. Задачей изобретения является получение малотоксичных низко- и высокозамещенных фосфатов декстрана в виде гидрогелей, содержащих дополнительно карбаматные группы и проявляющих противоопухолевое действие. Поставленная задача решается тем, что в качестве малотоксичного противоопухолевого высокомолекулярного соединения предложены гелеобразующие смешанные эфиры декстрана, содержащие фосфорнокислые и карбаматные группы, общей формулы 67231(2)22,где- степень замещения по фосфорнокислым группам,12 и имеет значение от 0,47 до 1,09 1 - степень замещения по моноэфирам и имеет значение от 0,01 до 0,48- число фосфатов в моноэфирах и имеет значение от 1 до 2 2 - степень замещения по диэфирам и имеет значение от 0,01 до 1,08- степень замещения по карбаматным группам и имеет значение от 0,39 до 1,23- степень полимеризации, 201000,обладающие антипролиферативной активностью по отношению к опухолевым клеткам. Способ получения смешанных эфиров декстрана по п. 1, при котором исходный декстран сушат, затем осуществляют этерификацию ортофосфорной кислотой в расплаве мочевины при мольном соотношении -ангидроглюкопиранозное звено декстранаортофосфорная кислотамочевина, равном 1(0,6-1,0)4,0, температуре 110-140 С и остаточном давлении 0,05-0,27 атм, охлаждают до комнатной температуры, добавляют воду до пастообразного состояния реакционной массы, затем обрабатывают 0,75 М раствором хлорида натрия в 70 -ном растворе этилового спирта,которого доведен гидроксидом натрия до значения 11,0-12,0, полученный осадок промывают 70 -ным раствором этилового спирта и сушат. Метод получения эфиров декстрана, содержащих фосфорнокислые и карбаматные группы, по сравнению с методом 12, модифицирован следующим образом для получения продуктов в виде гидрогелей исходный декстран предварительно перед реакцией этерификации высушивают при 50 С и остаточном давлении 0,1 атм в течение 5-16 часов процесс фосфорилирования декстрана ортофосфорной кислотой в расплаве мочевины проводят при остаточном давлении 0,05-0,27 атм. Этот параметр процесса фосфорилирования оказывает существенное влияние на выход фосфатов декстрана в виде гельфракции. При остаточном давлении 0,5 атм выход гель-фракции значительно снижается(примерно в 2 раза). При атмосферном давлении могут быть получены только низкозамещенные водорастворимые образцы фосфата декстрана для замены токсичного растворителя (метанол) в процессе промывки фосфатов декстрана, сокращения ее периода, а также получения -формы фосфорнокислых эфиров 3 16349 1 2012.10.30 продукт модификации после охлаждения реакционной массы, добавления дистиллированной воды осаждают 0,75 М раствором хлорида натрия в смеси этиловый спирт - вода(70 -ный раствор),которого доведен раствором гидроксида натрия до значений 11,012,0. Полученный осадок промывают в аппарате Сокслета 70 -ным раствором этилового спирта и сушат при 50 С в вакуумном шкафу при остаточном давлении 0,1 атм. В качестве исходного материала для получения заявляемых соединений используется декстран с молекулярной массойв пределах 40-1000 кДа. Способ позволяет получить малотоксичные гелеобразующие фосфаты декстрана, обладающие противоопухолевой активностью. При этомнабухших гидрогелей находится в пределах 7,2-7,4, что соответствуеткрови. Выход продуктов реакции, рассчитанный от теоретически возможного, - количественный. Изобретение иллюстрируют фигуры, таблицы, примеры. Фиг. 1 - электронные микрофотографии гранул исходного (1) и фосфатов (2, 3) декстранов 2 -0,48,0,42 3 -0,68,0,47. Фиг. 2 - зависимость количества поглощенной воды 1 г фосфата декстрана (1,091,23) от времени (, г/г). Фиг. 3 - динамика роста саркомы М-1 (, см 3) у крыс в контроле (4) и после внутрибрюшинного введения фосфата декстрана (0,480,42) в дозе 2,0 г/кг (5). Пример 1. К 20 г предварительно высушенного при 50 С и остаточном давлении 0,1 атм в течение 16 часов декстрана (40000 Да) при постоянном перемешивании добавляют 29,76 г мочевины (хч) и 5,2 мл 85 -ной ортофосфорной кислоты. Мольное соотношение(2)2 составляет 1,00,64,0. Выдерживают при температуре 125 С и остаточном давлении 0,06-0,25 атм в течение 3 часов. По окончании реакции фосфорилирования реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры. Затем добавляют дистиллированную воду для получения пастообразной массы, приливают 400 мл (модуль ванны (г/мл) 120) раствора(30 г на 1 л раствора 70 -ного этилового спирта,которого доводят гидроксидом натрия до значения 11,5) и оставляют при комнатной температуре на 24 часа. Выпавший осадок промывают в аппарате Сокслета 70 -ным раствором этанола,сушат при температуре 50 С в вакуумном шкафу при остаточном давлении 0,1 атм. Выход гель-фракции составляет 96,7 . Содержание фосфора в полученном образце составляет 7,0 , азота - 2,7 Степень замещения по фосфорнокислым группамравна 0,49 по карбаматным группам- 0,42. Количество поглощенной воды 1 г фосфата декстрана поглощает 174,6 г воды. Примеры 2-14. Образцы фосфатов декстрана получают аналогично примеру 1 при различных параметрах процесса. Условия осуществления процесса фосфорилирования для всех примеров приведены в табл. 1. Образцы фосфатов декстрана, полученные в соответствии с примерами 1-14, охарактеризованы по содержанию фосфорнокислых и карбаматных групп, структурным особенностям, степени набухания, кислотно-основным свойствам методами элементного анализа, ИК-спектроскопии, сканирующей электронной микроскопии, потенциометрического титрования. Элементный анализ. Содержание фосфорнокислых групп в образцах фосфатов декстрана определяют спектрофотометрическим методом 13, азота - методом Кьельдаля 14. Полученные соединения характеризуются по степени замещения по фосфорнокислым и карбаматнымгруппам (число фосфорнокислых или карбаматных групп, приходящихся на ангидроглюкопиранозное звено (ГПЗ) полисахарида). Полученные данные приведены в табл. 1. Таблица 1 Условия фосфорилирования и результаты химического анализа Условия фосфорилирования Свойства фосфатов декстрана Количество реагентов, ис,пользуемых в реакции эте- Мольное соМолекулярная Выход рификации Влажность отношение Время, Давление, масса дексТ, С гельдекстрана,Масса Объем Масса ГПЗ 34 час атм трана, кДа фракции,декстрана, 34, мочевины,(2)2 г мл г 2 40 11,5 5 2,15 7,42 1,01,04,0 120 2,5 0,05-0,07 9,3 1,6 0,68 0,25 в/р 3 40 0 3 1,29 4,45 1,01,04,0 120 2,5 0,05-0,07 10,5 4,2 0,92 0,81 92,8 5730 4 60 11,6 5 2,15 7,42 1,01,04,0 120 2,5 0,05-0,07 9,9 2,3 0,85 0,82 в/р 5 60 0 5 0,63 7,42 1,00,34,0 125 3,0 0,15-0,25 8,4 1,4 0,59 0,22 в/р 6 60 0 20 5,20 29,76 1,00,64,0 125 3,0 0,15-0,25 6,8 2,7 0,48 0,42 97,5 17970 7 60 0 20 6,90 29,76 1,00,84,0 125 3,0 0,15-0,20 8,9 2,8 0,68 0,47 98,5 3840 8 60 0 20 8,6 29,76 1,01,04,0 135 2,0 0,20-0,27 11,2 5,7 1,09 1,23 98,7 3620 9 500 8,2 5 0,22 0,65 1,00,10,35 135 3,0 0,05-0,07 0,9 1,2 0,05 0,16 в/р 10 500 8,2 5 0,645 3,71 1,00,32,0 135 2,0 0,05-0,07 4,6 1,0 0,28 0,13 в/р 11 500 0 3 0,77 4,46 1,00,64,0 115 3,0 0,06-0,07 9,4 5,8 0,85 1,16 98,2 6880 12 500 8,2 20 6,9 29,76 1,00,84,0 125 3,5 0,15-0,20 6,7 2,5 0,47 0,39 76,8 3300 13 500 8,2 5 2,15 7,42 1,01,04,0 125 3,0 0,07-0,10 11,5 4,8 1,08 0,99 87,9 3270 14 1000 12,8 5 2,15 7,42 1,01,04,0 120 2,5 0,07-0,10 10,9 2,9 0,91 0,53 в/р 16349 1 2012.10.30 ИК-спектроскопия. О наличии фосфорсодержащих групп в модифицированном декстране судили по увеличению интенсивности в ИК-спектрах заявляемого соединения полос поглощения в области 950-1050 см-1 и 1210-1240 см-1 . В ИК-спектрах всех образцов декстрана, этерифицированных ортофосфорной кислотой в расплаве мочевины,присутствует интенсивная полоса поглощения вблизи 1710 см-1, обусловленная асимметричными валентными колебаниями связейкарбаматных групп. С увеличением степени этерификации указанные спектральные изменения усиливаются. Сканирующая электронная микроскопия. В результате фосфорилирования (фиг. 1) гранулы декстрана разрушаются на неоднородные по длине и ширине осколки, которые имеют рыхлую, пористую структуру (размеры микропор находятся в интервале от 2 до 10 мкм). Увеличение степени замещения по фосфорнокислым группам в образцах способствует постепенному уплотнению структуры декстрана, увеличению размеров осколков и исчезновению микропор. Степень набухания. Водопоглощающую способность (, г/г) определяют гравиметрическим методом и рассчитывают по формуле 21100 ,2 где- водопоглощающая способность (, г/г) 1 - масса набухшего в воде образца, г 2 - масса образца, высушенного до постоянной массы, г. Гидрогели фосфатов декстрана отделяют от избытка воды центрифугированием на стеклянном фильтре с размером пор 160 мкм при центробежной силе 2400 . Высушивание до постоянной массы осуществляют в присутствии оксида фосфорапри температуре 50 С, остаточном давлении 0,1 атм. Значения водопоглощающей способности гидрогелей на основе фосфатов декстрана приведены в табл. 1 и на фиг. 2. Полученные гидрогели фосфатов декстрана характеризуются высокой скоростью водопоглощения водопоглощение гидрогелей с разным содержанием фосфорнокислых и карбаматных групп достигает своего максимального значения менее чем за 5 минут и с последующим течением времени практически не меняется (фиг. 2) - на примере фосфата с 60 кДа (1,091,23). Потенциометрическое титрование. Из данных табл. 2 следует, что полученные фосфаты декстрана имеют полную обменную емкость в диапазоне 1,3-3,2 мгэкв/г. Согласно значениям кажущихся констант ионизации (К 1 и К 2) в составе фосфатов декстрана имеется одна или же две кислые функциональные группы, которые диссоциируют в основном в области 1,8-5,4 и 5,0-9,0. Таблица 2 Результаты потенциометрического титрования гидрогелей на основе фосфатов декстрана Данные потенциометрического титрования ОЕ 1, мгэкв/г ПОЕ, мгэкв/г К 1 К 2 1 0,48 0,42 1,5 3,2 2,9 7,0 2 0,78 0,83 1,9 1,9 3,1 3 1,09 1,23 1,3 1,3 3,0 Исследование острой токсичности гидрогелей фосфатов полисахаридов. Определение острой токсичности гидрогелей ФД проводилось на крысах (каждая серия - по 4 крысы весом 200-250 г). Животным вводилось по 10 г 50 -ного гидрогеля внутрибрюшинно. Установлено (табл. 3), что фосфаты декстрана относятся к классу малотоксичных веществ. 6 16349 1 2012.10.30 Таблица 3 Острая токсичность гидрогелей фосфатов декстрана Полисахарид 50 Декстран (60000) 1,09 1,225000 мг/г Декстран (500000) 0,85 1,165000 мг/г Оценка противоопухолевой активности гидрогелей фосфатов декстрана. Сопоставительное исследование противоопухолевой активности предлагаемых фосфатов декстрана проведено в условияхи. Исследование противоопухолевой активности гидрогелей фосфатов декстрана. Оценку противоопухолевого эффекта гидрогелей на основе фосфатов декстрана проводили на монослойной культуре опухолевых клеток(эпителиоидная карцинома шейки матки человека, клон ) путем сравнения количества выживших клеток с их исходным числом до воздействия фосфатов декстрана. Снижение числа клетокпосле воздействия заявляемых соединений ниже исходного уровня свидетельствует о преобладании цитотоксического эффекта, а выше исходного, но ниже контроля - о преобладании цитостатического эффекта. Показатель эффективности противоопухолевого действия гидрогелей ИК 50 (концентрация, вызывающая ингибирование пролиферации на 50 ) рассчитывали методом регрессионного анализа полученных данных. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы 7. Результаты представлены в табл. 4. Видно, что с ростом содержания фосфорнокислых групп в декстране способность заявляемых эфиров ингибировать пролиферацию опухолевых клеток увеличивается. Цитостатическая активность исследованных соединений является дозозависимой. Таблица 4 Влияние исходного и фосфорилированного декстранов на рост культуры опухолевых клетокЧисло клеток (103) Прирост Пример,103,Концентрация,ИК 50,Полисахарид исх контролю контроль 18060 80545 625 100 1 72035 540 86 исходный 1 60 2,0 декстран 2 55055 370 59 1 50545 325 52 6,8 2,7 1,5 2 48030 300 48 фосфат 2 60 декстрана 1 50520 325 52 8,9 2,8 1,1 2 41020 230 37 1 65863 478 76 исходный 3 500 2,0 декстран 2 62530 445 71 1 57065 390 62 фосфат 4 500 9,4 5,8 1,7 декстрана 2 46020 280 45 Исследование противоопухолевой активности. Эффективность противоопухолевого действия гидрогелей на основе фосфатов декстранабыла проверена на белых беспородных крысах обоего пола (16 животных), которым подкожно в область левого бедра перевивали саркому -1. На 7-10 сутки после перевивки опухоли крысам однократно внутрибрюшинно (доза 2000 мг/кг) вводили гидрогель фосфата декстрана. Измерения размеров опухолей в кон 7 16349 1 2012.10.30 трольных и опытных группах проводили 3 раза в неделю, а объем опухоли (, см 3) рассчитывали по формуле Шрека/6, где , , с - линейные размеры опухоли (см). Торможение роста опухоли определяли по формуле(ср. (контроль) - ср. (опыт / ср. (контроль). Полученные результаты (фиг. 3) выявляют противоопухолевую активность заявляемых соединений. Через двое суток после введения фосфатов декстрана разница в скорости роста опухолевых клеток опытной партии, по сравнению с контрольной, становится очевидной на 7 сутки объем опухоли, по сравнению с контролем, уменьшается примерно в два раза. Таким образом, модификация декстрана смесью ортофосфорной кислоты и мочевины приводит к образованию малотоксичных соединений, обладающих противоопухолевым действием. Заявляемое соединение обеспечивает, по сравнению с декстраном и существующими фосфатами декстрана, следующие преимущества соединения могут быть получены в виде гидрогелей в достаточно широком диапазоне изменения содержания фосфорнокислых групп и молекулярной массы декстрана гидрогели на основе фосфатов декстрана обладают высокой скоростью набухания при получении используются сравнительно нетоксичные реагенты, что делает стадию очистки целевого продукта более простой и экономичной. Предложенные фосфаты декстрана могут быть получены в условиях предприятий,выпускающих химические и фармацевтические препараты. Источники информации 1. Патент 90/04970, МПК 561 31/725, 1990. 2..,.,.,.,.... - 1988. - . 85. . 6132-6136. 3.20060154896, МПК 61 31/721, 2006. 4.6303148, МПК 61 9/16,61 9/14, 2001. 5.4847091, МПК 61 9/66, 1989. 6..,.,Т.,.- , -., 1977. - . 53. - . 223-229. 7.2970141, МПК 12 19/08,12 19/00, 1961. 8..,.,. .,.. . - 2004. - . 45. . 6431-6435. 9.,., 1969. - . 13. - . 396-401. 10.. 1 184 032, МПК 61 9/16,08 37/00, 2002. 11..,., . . - 1992. - . 193. - . 4. . 983-990. 12.6703496 1, МПК 08 31/00,08 31/06,08 33/00,08 33/02,08 35/00,2004. 13. Колориметрические (фотометрические) методы определения неметаллов Пер. с англ. / Под ред А.И.Бусева. - М. ИЛ, 1963. - 260 с. 14. Губен-Вейль. Методы органической химии. - М. Госхимиздат, 1963. - 468 с. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 9