Способ тестирования наличия токсичности у титанового сплава, предназначенного для использования в качестве имплантационного материала

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ТЕСТИРОВАНИЯ НАЛИЧИЯ ТОКСИЧНОСТИ У ТИТАНОВОГО СПЛАВА, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ ИМПЛАНТАЦИОННОГО МАТЕРИАЛА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Новик Галина Ивановна Сидоренко Анастасия Вячеславовна Рахуба Денис Викторович Ижик Анастасия Владимировна Гордиенко Анатолий Илларионович Вегера Иван Иванович Доста Анатолий Дмитриевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ тестирования наличия токсичности у титанового сплава, предназначенного для использования в качестве имплантационного материала, отличающийся тем, что осуществляют культивирование клеток штаммаБИМ В-87 Д в жидкой питательной среде в течение 24 часов при 37 С в присутствии и в отсутствии тестируемого сплава и определяют уровни накопления биомассы, при этом о наличии токсичности у сплава судят, если при культивировании клеток в присутствии сплава уровень накопления биомассы ниже. Изобретение относится к медицине и биотехнологии, в частности к созданию имплантационных материалов, предназначенных для внедрения в организм человека, и может найти применение в качестве теста для оценки токсичности разрабатываемых материалов. Наибольшее распространение для изготовления имплантатов получили металлические материалы, в частности титан и титановые сплавы, сплавы на основе кобальта. Из титана и его сплавов различными отечественными и зарубежными фирмами изготавливаются различные компоненты имплантатов, в частности компоненты эндопротеза тазобедренного сустава. Такие протезы обладают высокой коррозионной стойкостью, биосовместимостью, однако по прочности и износостойкости уступают изделиям из кобальтовых 14820 1 2011.10.30 сплавов. Сплавы на основе кобальта имеют высокий запас прочности, высокую коррозионную стойкость в физиологическом растворе, биосовместимость. Биосовместимость является одним из основных требований, предъявляемых к материалам медицинского назначения. Исходя из этого, комплексное исследование воздействия имплантационных материалов на живые клетки, а также на целый организм является обязательным этапом разработки и внедрения имплантатов. Данные исследования включают исследование неспецифической и специфической токсичности в лаборатории, а также клинические испытания на добровольцах. Известен способ тестирования пористых титановых имплантатов путем засевания материала фетальными гепатоцитами человека с последующей имплантацией в организм мыши 1. Данный способ требует специально обученного персонала для вживления имплантатов в организм мыши, представляется крайне трудоемким, дорогим и занимает много времени. Известны способы тестирования имплантационных материалов в условияхс использованием клеток человеческого костного мозга 2, а также фибробластов и остеобластов 3. Использование клеток человеческого организма связано с рядом моральноэтических трудностей, что делает нецелесообразным применение данных способов на ранних этапах разработки имплантационных материалов. Наиболее близким по достигаемому результату является способ тестирования титанового сплава с использованием культивирования клеток костного мозга мыши в присутствии исследуемого материала в культуральной жидкости (12,5 ЭТС, 12,5 лошадиной сыворотки, 300 мг/л -глутамина, 2,5102 М 2-меркаптоэтанола, 10-6 гидрокортизона гемисукцината и 75-1640) при 37 С и 52 в течение 6 недель с последующим подсчетом ядросодержащих, а также жизнеспособных миелоцитов и морфологическим анализом клеток 1. Несмотря на то что использование клеток крови в качестве индикатора токсичности позволяет максимально приблизить условия эксперимента к условиям, данный метод имеет некоторые недостатки применение клеток крови, получаемых из живых мышей, а также сложных питательных сред делает способ дорогостоящим большое количество лабораторных манипуляций (извлечение костного мозга, обработка тестируемых материалов), продолжительное культивирование (6 недель) и сложные тесты делают метод трудоемким и приводят к большим затратам времени нецелесообразность применения данного метода для исследования общей токсичности на ранних стадиях исследования, вытекающая из предыдущих пунктов. Задачей данного изобретения является разработка более эргономичного, быстрого и дешевого способа тестирования материалов на предмет наличия токсичности. Поставленная задача решается за счет использованияБИМ В-87 Д в качестве тест-культуры, применения недорогих питательных сред для культивирования, простых тестов для оценки токсичности исследуемых имплантационных материалов. Высокая скорость роста данных микроорганизмов обеспечивает быстрое получение легко интерпретируемых материалов. Бифидобактерии являются эволюционно сложившимися симбионтами человеческого организма и населяют толстый кишечник, что делает их удобным объектом для использования в качестве тестового клеточного материала. Исследуемые материалы стерилизуют и помещают в жидкую или плотную питательную среду, после чего засевают культурой бифидобактерий и культивируют при 37 С в анаэробных условиях. Для культивирования используют триптон-лактозную (ТЛ) среду (триптон - 1 , лактоза - 1 , дрожжевой экстракт - 0,5 , натрия казеинат - 0,1 , аскорбиновая кислота 0,05 , 24122 - 0,2 , 24 - 0,2 , 4 - 0,1 ,- 0,1 , цитрат аммония двухводный - 0,3 , агар-агар - 0,1 ,6,8-7,0) и среду МРС 4. 14820 1 2011.10.30 После проведения культивирования проводят ряд тестов для определения токсичности материалов, включающие измерение уровня накопления биомассы, , определение числа живых клеток, исследование морфологии клеток. Штамм бифидобактерийБИМ В-87 Д, используемый в качестве тест-культуры, а также штаммыМС-42, .ГО-13, .1, .В 379 М получены из фонда Научной коллекции типовых и промышленно-ценных непатогенных микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси (Белорусская коллекция непатогенных микроорганизмов). Суть предлагаемого изобретения иллюстрируется приведенными ниже примерами. Пример 1 Краткосрочное исследование токсичности титановых сплавов в жидкой среде. Материалом для исследований служат образцы титановых сплавов марки ВТ-6,отожженные при 1000 С с последующей закалкой в воде (сплав 1) или на воздухе(сплав 2), и ВТ 1-0, отожженные при 920 С с закалкой в воде (сплав 3) или на воздухе (сплав 4). Пластинки изучаемых сплавов диаметром 10 мм и высотой 1 мм автоклавируют при 121 С в течение 30 минут и стерильно помещают в колбы с жидкой средой ТЛ, которые засевают культурами бифидобактерий. В качестве инокулята используют 18-часовые физиологически активные ( генерация) культуры бифидобактерий. Посевной материал вносят в количестве 5 от общего объема. Культивирование проводят в термостате при 37 С. Параллельно каждую из бактериальных культур в таком же количестве вносят в колбы со средой, не содержащие сплава (контроль), и инкубируют в тех же условиях, что и опытные варианты. Через 24 часа культивирования проводят комплексную оценку влияния исследуемых сплавов на культуры бифидобактерий. Об уровне накопления биомассы судят по измерению оптической плотности при 590 нм. Уровень метаболической активности культур определяют по изменению активной кислотности среды . Количество жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) определяют методом предельных разведений полужидкой (0,2 агара) тиогликолевой среды. Изучение морфологии клеток бактерий из опытных и контрольных вариантов осуществляют методом фазово-контрастной микроскопии нативных препаратов. Ниже представлены данные о накоплении биомассы (фиг. 1), титру живых клеток в культуральной жидкости (фиг. 2) и уровню(табл. 1), измеренному через 24 часа культивирования бифидобактерий в присутствии титановых сплавов. Таблица 1 Уровеньчерез 24 часа культивирования Штамм/вариант контроль сплав 1 сплав 2 сплав 3 сплав 4.В 379 М 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 Во всех случаях показатели накопления биомассы и активной кислотности среды в контрольных и опытных вариантах достоверно не отличаются. Титр клеток бифидобактерий, выращенных в присутствии образцов титановых сплавов, соответствует показателям контрольных вариантов. Пример 2 Краткосрочное исследование токсичности титанового сплава марки ВТ-6, подвергнутого скоростной термообработке и ионно-лучевому легированию азотом и водородом, при культивировании пробиотических бактерий в жидкой среде. 3 14820 1 2011.10.30 Материалом для исследования служили образцы титанового сплава марки ВТ-6, которые прошли следующую обработку нагрев до 1000 С, закалка в воде и последующее ионно-лучевое легирование азотом и водородом, по следующим режимам- сплав марки ВТ-6 - ионно-лучевое легирование азотом и водородом при 500 С с выдержкой 3 часа- сплав марки ВТ-6 - ионно-лучевое легирование азотом и водородом при 450 С с выдержкой 3 часа. В результате обработки на поверхности образцов титанового сплава марки ВТ-6 было получено модифицированное покрытие толщиной 20 мкм. Исследования выполняли аналогично примеру 1. Результаты, полученные при изучении влияния присутствия исследуемых образцов титанового сплава марки ВТ-6 на накопление биомассы и активность кислотообразования культур пробиотических бактерийБИМ В-87 Д, .791,..Б-1, ..Б-6, .БИМ В-423, суммированы в табл. 2. Таблица 2 Контроль А В Тест-культура/сплав ОП 600.БИМ В-423 0,768 4,96 0,638 4,94 0,636 4,94 Как видно из представленных данных, присутствие в среде культивирования образцов титанового сплава марки ВТ-6, подвергнутых скоростной термообработке и ионнолучевому легированию, приводило к значительному ингибированию пролиферативной активности исследуемых пробиотических бактерий-87 Д,.791, ..Б-1, ..Б-6, .БИМ В-423 (уменьшение показателей накопления биомассы более чем на 20 ). Пример 3 Тестирование токсичности титановых и кобальтовых сплавов при культивировании микроорганизмов на поверхности плотных питательных сред. Материалом для исследований служат образцы титановых сплавов марки ВТ-6 и ВТ 1-0,а также образец сплава на основе кобальта. В центре чашек Петри с агаризованной (1,5 агара) средой ТЛ формируют лунки диаметром 15 мм, в которые стерильно помещают пластинку одного из исследуемых сплавов. Чашки инокулируют 10 мл бактериальной суспензии ( 106 КОЕ/мл) и помещают в станцию для выращивания микроаэрофильных микроорганизмов( , Англия). Инкубацию проводят при 37 С в смеси газов 102, 102, 802 в течение 21 дня. Оценку токсичности проводят визуально, учитывая наличие и обильность роста микроорганизмов на границе агар-сплав и поверхности исследуемого материала. Результаты суммированы в табл. 3. Таблица 3 Рост на границе Рост на поверхности Сплав Культура Рост на чашке агар-сплав сплава 14820 1 2011.10.30 Культуры бифидобактерий одинаково хорошо росли на плотной питательной среде,границе агар-сплав и поверхности исследуемых материалов, погруженных в жидкую среду ТЛ. Пример 4 Долгосрочное исследование токсичности титановых сплавов в жидкой среде. Материалом для исследований служат образцы титановых сплавов марки ВТ-6,отожженные при 1000 С с последующей закалкой в воде (сплав 1) или на воздухе(сплав 2), и ВТ 1-0, отожженные при 920 С с закалкой в воде (сплав 3) или на воздухе (сплав 4). Пластинки исследуемых сплавов автоклавируют и помещают в колбы на 50 мл. Колбы заполняют стерильной средой ТЛ, инокулируют (5 об.) 18-часовыми ( 107 КОЕ/мл) культурами бифидобактерий и инкубируют в термостате при 37 С. Параллельно культуры вносят в колбы со средой ТЛ, не содержащие сплава (контроль), которые выдерживали в тех же условиях, что и опытные варианты. Через 24 часа культивирования колбы с опытными и контрольными вариантами, после коррекциисреды в диапазоне 6,8-7,0 насыщенным раствором гидрокарбоната натрия, помещают на хранение в холодильную камеру при 4 С. Жизнеспособность культур определяют через 3 месяца хранения, измеряя количество живых клеток в 1 мл среды (КОЕ/мл, табл. 4). Таблица 4 Титр клеток (КОЕ/мл) бифидобактерий через 3 месяца культивирования Штамм контроль сплав 1 сплав 2 сплав 3 сплав 4.В 379 М 2,010 5,810 2,710 2,0104 Титры клеток .БИМ В-87 Д, .МС-42, .ГО-13 через 3 месяца хранения в присутствии сплава 1 и .В 379 М в присутствии сплава 4 не отличаются от показателей в контрольных вариантах. В то же время наблюдается полная потеря жизнеспособности .ГО-13 и .1 в присутствии сплава 2, а также .В 379 М в присутствии сплава 1. Пример 5 Краткосрочное исследование токсичности материала из прессованного губчатого порошка титана в жидкой среде с использованием полистирольного планшета. Материалом для исследований служат образцы материала из прессованного губчатого порошка титана марки ВТ-10. Образцы изучаемого материала диаметром 5 мм и высотой 4 мм автоклавируют и стерильно помещают в лунки полистирольного планшета с жидкой средой, которые засевают культурой .БИМ В-87 Д. В качестве инокулята используют 24-часовую физиологически активную ( генерация) культуру бифидобактерий. Посевной материал вносят в количестве 5 от общего объема. Культивирование проводят в термостате при 37 С. Через 24 часа культивирования проводят оценку влияния исследуемого сплава на культуру .БИМ В-87 Д. Об уровне накопления биомассы судят по измерению оптической плотности при 590 нм. В табл. 5 представлены данные о накоплении биомассы через 24 часа культивирования .БИМ В-87 Д в присутствии исследуемого материала. Показатели накопления биомассы бифидобактерий при культивировании в присутствии прессованного титанового порошка не отличаются от контрольного значения, что свидетельствует об отсутствии токсичности исследуемого материала. Согласно полученным данным, предлагаемый новый способ тестирования имплантационных материалов на предмет наличия токсичности по ряду показателей превосходит ранее предложенный метод с использованием клеток костного мозга мышей (прототип). Преимущества предлагаемого метода заключаются в следующем 1. Бифидобактерии, используемые в качестве тест-объекта, менее требовательны к условиям культивирования и питательным средам по сравнению с клетками костного мозга, что делает их более удобным объектом для исследования. 2. Применимость метода для тестирования как острой, так и пролонгированной токсичности имплантационных материалов. 3. Более низкая стоимость исследования, по сравнению с прототипом, обусловленная отсутствием необходимости использования лабораторных животных и использованием более дешевых питательных сред для культивирования бифидобактерий. 4. Небольшое количество лабораторных манипуляций и непродолжительное время культивирования для краткосрочного теста, обеспечивающие минимальные затраты времени на проведение теста. 5. Нетрудоемкие тесты по оценке действия исследуемого материала на тест-объект,обеспечивающие получение достоверных результатов. Источники информации 1. Итин В.И., Прибытков Г.А., Хлусов И.А., Загребин Л.В., Шестов С.С. Имплантат носитель клеточного материала из пористого титана // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2006. -3. - С. 59-63 (аналог, прототип). 2..,.,.,.,.,.,// .. - 1998. - . 40, . 2. - . 301-306. 3..,.,,.,.,.1262// . - 2002. - . 23, . 14. - . 2863-2869. 4.,.,// Фиг. 1 На фиг. 1 представлены данные по накоплению биомассы культурами бифидобактерий через 24 часа культивирования их в присутствии титановых сплавов. 1 - .БИМ В-87 Д,2 - .ГО-13,3 - .МС-42,4 - .1,5 - .В 379 М. Фиг. 2 На фиг. 2 представлены данные о количестве жизнеспособных клеток в культурах бифидобактерий через 24 часа культивирования в присутствии титановых сплавов. 1 - .БИМ В-87 Д,2 - .ГО-13,3 - .МС-42,4 - .1,5 - .В 379 М. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7