Штамм гриба Lentinus edodes БИМ F-305 Д – продуцент полисахаридов, обладающих иммунотропной активностью

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Бабицкая Валентина Григорьевна Пучкова Татьяна Антоновна Щерба Виктор Васильевич Рожкова Зоя Афанасьевна Филимонова Татьяна Васильевна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в медицинской промышленности и касается нового штамма гриба- продуцента полисахаридов. Биомасса и полисахариды гриба могут найти применение в качестве источника лекарственных и лечебно-профилактических веществ, усиливающих иммунитет, обладающих антиоксидантной, радиопротекторной, антимикробной, гиполипидемической и др. активностями. Высший базидиальный гриб шиитаке более 2000 лет используется в народной медицине стран Юго-Восточной Азии. В его плодовых телах и мицелии обнаружены вещества, стимулирующие иммунную систему, обладающие противоопухолевыми, гепатопротекторными, антиоксидантными, антибактериальными, противовирусными и противогрибными свойствами, способные регулировать кровяное давление, понижать содержание холестерина и сахара в крови и др. 1. Биологическую активность этого гриба, наряду с другими соединениями, определяют полисахариды, важнейший из которых - полисахарид лентинан -1-3-гликан), получаемый из плодовых тел и одобренный в Японии в качестве лекарственного препарата при лечении некоторых онкологических заболеваний. Однако выращивание плодовых тел - достаточно длительный и трудоемкий процесс (3-4 месяца). В настоящее время более перспективно глубинное культивирование грибов на жидких питательных средах, позволяющее получать за короткие сроки стандартизированную полисахаридсодержащую биомассу. 11136 1 2008.10.30 Известен штамм 01 - продуцент биомассы, обладающий высокой продуктивностью и ярко выраженным грибным ароматом 2, и способ получения биомассы гриба 3. Гриб выращивают на питательной среде следующего состава, г/л пивное сусло - 270-320, меласса - 50-70, подсолнечное масло - 0,5-1,5, вода остальное. Культивирование осуществляют в течение 8-10 дней при температуре 26-27 С и рН 4,5-5,0. Недостатком штамма является необходимость культивирования его на питательных средах с высоким содержанием углеводов, неизвестно количество образуемых полисахаридов. Известен способ выращивания съедобных грибов, включающий приготовление мицелиальной биомассы путем глубинного культивирования на питательной среде и получение плодовых тел путем посева мицелиальной биомассы на субстрат. Культивирование осуществляют в присутствии хлорида марганца, а мицелиальную биомассу готовят до стадии образования пигментированной мицелиальной пленки 4. Известно использование глубинного мицелия .для получения косметических средств 5. Однако в этих патентах отсутствуют данные об образовании эндо- и экзополисахаридов. Наиболее близкими по технической сущности и достигаемому результату являются штаммы .18992, способный образовывать иммуностимулирующие экзополисахариды 6 и штамм .007 - продуцент противоопухолевого и антивирусного эндополисахарида -2 7. Штамм .18992 выращивают на питательной среде, содержащей глюкозу, сусло-экстракт, дрожжевой экстракт и пептон в различных концентрациях. Гриб культивируют при температуре 22-31 С, рН 3-7 в течение 8-33 сут. (в колбах (инокулюм) - 6-21 сут., затем в ферментере - 2-12,5 сут. (50-300 ч. Однако штамм характеризуется недостаточно высокой продуктивностью. Штамм .007 выращивают в колбах, а затем в ферментере на среде, основу которой составляют отходы производства ячменной водки. Выход эндополисахарида- 0,7 г/л или 5,8 в биомассе. (Гриб выращивают в ферментере объемом 10 л. Получено 12,5 г/л сухой биомассы, рис. 1 в ссылке 7. Из этой биомассы - 125 г/10 л - получено 7 г полисахарида, что составляет 5,8 в биомассе, либо 0,7 г/л). Данные штаммы взяты за прототип. Однако штаммы характеризуются недостаточно высокой физиологической активностью и низким образованием полисахаридов. Недостатками данных штаммов являются Для .18992 низкий выход биомассы - 3-5 г/л низкий выход экзополисахаридов - 0,1-0,23 г/л длительное культивирование (до 300 ч (12,5 сут.) в ферментере). Для .007 длительность культивирования - 30 сут. (10 суток в колбах объемом 500 мл, 10 суток в колбах объемом 1000 мл, 10 суток в 10 л ферментере). низкий выход эндополисахаридов - 5,8 в сухой биомассе либо 0,7 г/л. Задачей изобретения является получение путем естественной селекции более продуктивного по синтезу полисахаридов штамма, способного расти на более широком спектре относительно дешевых и простых по составу питательных сред, сокращения сроков получения конечного продукта. Предлагаемый штамм .БИМ -305 Д выделен в виде тканевых изолятов коммерческих плодовых тел (фармкультура), получен путем естественной селекции и депонирован в коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси. Культура также поддерживается в коллекции мицелиальных грибов лаборатории экспериментальной микологии ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси. Штамм хранится при 4-6 С на сусло-агаре, на сусло-агаре с добавлением 0,5 опилок. 2 11136 1 2008.10.30 Культурально-морфологическая характеристика. Агаризованное сусло. Колонии ватообразные, средней плотности, белые, воздушный мицелий невысокий, в начале роста паутинистый, сравнительно негустой, затем преобразуется в более высокий ватообразный, запах слабый, грибной. Край колонии ровный, с возрастом поднимающийся, на реверзуме заметны концентрические круги (зоны роста) и темнопигментированные участки разной величины. Генеративные гифы септированные,разветвленные, переплетающиеся в разных направлениях. На мицелии хорошо видны многочисленные мутовчатые пряжки, как простые, так и медальонные. Изредка встречаются анастомозы. В глубинной культуре на средах с молочной сывороткой рост мицелия дисперсный,пеллеты удлиненные, на концах округлые, иногда с тяжами, длиной - 3-6 мм, шириной 0,1-0,6 мм. Физиолого-биохимическая характеристика. Культура утилизирует моносахариды (арабиноза, галактоза, глюкоза, ксилоза, манноза, фруктоза), дисахариды (лактоза, мальтоза, сахароза, целлобиоза), полиолы (маннит,сорбит, дульцит), полисахариды (крахмал, целлюлоза). В качестве источников азота использует неорганические (3, 43, 4, (4)24) и органические (пептон,аспарагиновую кислоту, кукурузный, дрожжевой экстракт). Растет в диапазоне температур 15-30 С, оптимальная температура для роста - 2325 С. Диапазон рН - 3,0-7,0, с оптимумом - 4,5-5,0. Для роста требует кислород воздуха. Штамм не патогенен, токсических метаболитов не образует. Токсикологические исследования штамма (глубинного и поверхностного мицелия) проводились на лабораторных животных крысы, беспородные белые мыши, морские свинки, кролики. Установлено, что сам штамм и мицелий не обладают кумулятивными свойствами, в условиях повторного внутрижелудочного введения в массивных дозах не способны к формированию токсических факторов, приводящих к нарушению жизнедеятельности отдельных органов, систем и организма в целом. Не обладают раздражающим и общерезорбтивным действием, не обладают сенсибилизирующей активностью и не представляют опасности аллергенного поражения, не обладают кожным ирритативным и кожно-раздражающим действием. Не выявлены функциональные и структурные нарушения со стороны жизненно важных систем организма. Проведенные исследования позволяют сделать заключение о безвредности гриба для организма. На модели окисления линолевой кислоты установлена высокая антиоксидантная активность глубинного и поверхностного мицелия (до 90 и выше по отношению к ионолу- известному антиоксиданту). Спиртовые экстракты подавляли автоокисление линолевой кислоты и образование продуктов перекисного окисления, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой. Сведения, подтверждающие образование полисахаридов и других компонентов штаммом .БИМ -305 Д на различных питательных средах. Пример 1 Культуру гриба .БИМ -305 Д выращивают на скошенном сусло-агаре при 23-25 С в течение 7-10 сут., затем переносят культуру стерильной лопаткой или шпателем в качалочные колбы вместимостью 1 л с 300 мл стерильной среды - пивное неохмеленное сусло 5 Б, рН среды 5,0-6,0. Штамм культивируют на качалке (160-180 об./мин.) при 23-25 С в течение 8-10 сут. Общее время культивирования - 15-20 сут. Полученный мицелий фильтруется, промывается водой и сушится в токе теплого воздуха при температуре не выше 60 С. В культуральной жидкости и полученном мицелии определяют содержание экзо- 8 и эндополисахаридов 9, другие показатели. 3 11136 1 2008.10.30 Биомасса, г/л 10,0 Эндополисахарид,10,0 Экзополисахарид, г/л 4,0 Белок,23,0 Липиды,9,0 Линолевая кислота,в липидах 69,0 Фенольные соединения, мг/ 1800,0 Меланин,0,7 Антиоксидантная активность,80,0. Использование предложенного штамма позволило увеличить по сравнению с прототипом выход экзополисахаридов - в 17-40 раз эндополисахаридов - в 1,8 раза. Пример 2 Выращивание гриба осуществляется аналогично изложенному в примере 1. В качестве питательной среды используется минеральная среда с глюкозой глюкоза - 30,0 г/л,(4)24 - 5 г/л, Н 2 РО 4 - 1,0 г/л, 2 НРО 4 - 1,0 г/л, 4 - 0,25, кукурузный экстракт 2,0 г/л, вода водопроводная до 1 л, рН - 5,0-6,0. Показатели Биомасса, г/л 10,0-12,0 Эндополисахарид,10,0 Экзополисахарид, г/л 4,0 Белок,20,0 Липиды,8,0 Линолевая кислота,в липидах 65,0 Фенольные соединения, мг/ 1700,0 Меланин,1,2 Антиоксидантная активность,80,0. Использование предложенного штамма и подбора питательной среды позволило увеличить по сравнению с прототипом экзополисахариды - в 17-40 раз эндополисахариды - в 1,8 раза. Пример 3 Выращивание гриба осуществляется аналогично изложенному в примерах 1, 2. В качестве питательной среды используется сухая молочная сыворотка - 20 г/л, меласса - 20 г/л,(4)24 - 5,0 г/л, дрожжевой экстракт - 1,0 г/л, вода водопроводная - остальное, рН 5,0-6,0. Показатели Биомасса, г/л 15,0-16,0 Эндополисахарид,11,0-12,0 Экзополисахарид, г/л 3,5-4,0 Белок,24-25 Липиды,9-10,0 Линолевая кислота,в липидах 70,0 Фенольные соединения, мг/ 1900,0 Меланин,1,5 Антиоксидантная активность,85,0. Использование предложенного штамма и подбора питательной среды позволило увеличить по сравнению с прототипом экзополисахариды - в 17-40 раз эндополисахариды - в 1,9 раза. 4 11136 1 2008.10.30 Пример 4 Выращивание гриба осуществляется аналогично, изложенному в примерах 1-3. Выращенный в колбах мицелий стерильно переносят в ферментер объемом 10 л с 7 л любой (по пп. 1-3) питательной среды. Культивирование ведется при аэрации 0,5 л воздуха, /л среды/мин, температуре 23-25 С. Длительность культивирования - 72-96 ч. Показатели Биомасса, г/л 11,0-15,0 Эндополисахарид,8,0-10,0 Экзополисахарид, г/л 4,5-5,0 Белок,23,0-25,0 Липиды,11,5-12,0 Линолевая кислота,в липидах 60,0-70,0 Фенольные соединения, мг/ 1600,0-1800,0 Меланин,1,3 Антиоксидантная активность,85,0-90,0. Использование предложенного штамма и способа культивирования позволило увеличить по сравнению с прототипом экзополисахариды - в 22-45 раз эндополисахариды - в 1,4-1,8 раз. Пример 5 Глубинный мицелий гриба получают аналогично изложенному в примерах 1-4. Полисахариды из глубинного мицелия и культуральной жидкости выделяют по 8, 9. Растворы эндополисахаридов готовят в дистиллированной воде при нагревании, экзополисахаридов - в дистиллированной воде при нагревании (водорастворимая фракция) или в 10 при нагревании с последующим диализом против дистиллированной воды (щелочерастворимая фракция). Для определения способности полисахаридов стимулировать фагоцитарную активность нейтрофилов использовался фагоцитарный тест. Метод основан на определении с помощью светового микроскопа поглотительной способности нейтрофилов крови по отношению к микробной тест культуре после их совместной инкубации. В качестве тест-культуры использован. Установлено, что в опытеэндополисахариды, полученные из глубинного мицелия .БИМ -305 Д,активно стимулируют фагоцитарную активность нейтрофилов по отношению к .в концентрации свыше 100 мкг/мл. Более низкие концентрации (1 и 10 мкг/мл) также влияют на интенсивность фагоцитоза, однако различия с контролем статистически незначимы(табл. 1). Так же как и эндополисахариды, внеклеточные полисахариды, синтезируемые грибом в культуральную среду, оказывают стимулирующий эффект на интенсивность фагоцитоза. Статистически значимое увеличение фагоцитарного числа по сравнению с контролем получено для обеих фракций экзополисахаридов также при концентрации 100 мкг/мл и выше. Таблица 1 Влияние полисахаридов .БИМ -305 Д на фагоцитарную активность нейтрофилов Полисахариды 11136 1 2008.10.30 Продолжение табл. 1 Полисахариды Концентрация, мкг/мл Фагоцитарное число Контроль 7,61 1 7,74 Экзополисахариды, водо 10 7,97 растворимая фракция 100 9,34 200 9,38 300 9,40 Контроль 9,32 1 9,66 Экзополисахариды, щело 10 9,73 черастворимая фракция 100 11,67 200 11,74 300 11,69 Примечание- отличие от контроля статистически значимо при Р 0,05. Пример 6 Глубинный мицелий гриба получают аналогично изложенному в примерах 1-4. Для изучения иммунотропной активности использовали контрольную и опытную группу мышей, получавших ежедневно в течение 10 сут.глубинный мицелий гриба из расчета 2,5 г/кг. Индукция иммунного ответа производилась суспензией эритроцитов барана(0,1 мл суспензии в концентрации 1108 клеток/мл на мышь) по стандартной схеме иммунизации. Исследование иммунотропной активности глубинного мицелия .БИМ -305 Д показало, что мицелий гриба стимулировал развитие гуморального иммунного ответа,индуцированного эритроцитами барана по стандартной схеме. Так, в опытной группе обнаружена тенденция к увеличению селезеночного индекса, числа антителообразующих клеток селезенки. Достоверностью отличались различия титра гемагглютининов в опытной группе мышей увеличен по сравнению с контрольной группой уровень гемагглютининов класса М. В отношении гемагглютининов классатакже прослеживалась тенденция к увеличению (табл. 2). Гриб при введениименьше влиял на неспецифическую резистентность массу тела, уровень лейкоцитов, лейкоцитарную формулу и состояние системы комплемента, на показатель специфического клеточного иммунитета,индуцированного эритроцитами барана - реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Таблица 2 Влияние глубинного мицелия .БИМ -305 Д на специфическую резистентность Контрольная группа Масса селезенки, г Селезеночный индекс Число антителообразующих клеток селезенки 143,241,6 165,820,8(в 1000 спленоцитов) Титр гемагглютининов , 2 3,50,55 5,30,52 Титр гемагглютининов , 2 2,50,5 2,90,4 Выраженность реакции ГЗТ - индекс ГЗТ,6,72,6 6,92,9 Таким образом, использование предлагаемого штамма позволяет повысить выход биомассы, экзо- и эндополисахаридов, сократить время культивирования (табл. 3). 11136 1 2008.10.30 Таблица 3 Сравнительная характеристика предлагаемого нового штамма.БИМ -305 Д и штаммов-прототипов Предлагаемый новый штамм .Прототипы БИМ -305 Д(В колбах - инокулюм) 6-21 сут. В колбах на качалке - 14 сут. В ферментере - 2-12,5 В ферментере - 11 сут. (7 сут. в колбах сут. (50-300 ч)(инокулюм), 4 сут. - ферментер) Эндополисахарид - 8-125,8 либо 1,0-1,9 г/л либо 0,7 г/л Экзополисахарид - 4,0-5,0 г/л 0,1-0,23 г/л Существенно и то, что у штамма обнаружены новые, не известные ранее для грибов.свойства высокая антиоксидантная активность, способность синтезировать значительное количество фенольных соединений - натуральных антиоксидантов, образовывать большое количество липидов с высоким содержанием (до 70 ) непредельной линолевой кислоты, меланина - до 1,3 . В опытахустановлено, что эндо- и экзополисахариды гриба .БИМ 305 Д оказывают стимулирующий эффект на фагоцитарную активность нейтрофилов в концентрации свыше 100 мкг/мл. В опытахна мышах установлено иммунотропное действие глубинного мицелия предлагаемого штамма. Мицелий стимулировал развитие гуморального иммунного ответа, индуцированного эритроцитами барана. Источники информации 1.,.(.) . Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7