Штамм Ganoderma lucidum БИМ F-325 Д – продуцент полисахаридов, обладающий антиоксидантной активностью

(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Бабицкая Валентина Григорьевна Щерба Виктор Васильевич Осадчая Ольга Владимировна Пучкова Татьяна Антоновна Смирнов Денис Алексеевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) ШтаммБИМ -325 Д - продуцент полисахаридов, обладающий антиоксидантной активностью. Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в медицинской промышленности и касается нового штамма - продуцента полисахаридов, которые могут найти применение в качестве лекарственных и лечебно-профилактических веществ, усиливающих иммунитет, обладающих антиоксидантной, радиопротекторной, антимикробной, гиполипидемической и др. активностями. Известен штамм- продуцент протеогликана 009, обладающий противоопухолевой и иммуностимулирующей активностями 1. Протеогликан выделяют из глубинного мицелия гриба. Недостатком штамма является необходимость культивирования его на питательных средах с высоким содержанием глюкозы (50 г/л) и пептона(20 г/л) в длительные сроки. Время культивирования - 27 сут. (2 раза растят инокулюм по 10 сут.). 7 сут. - получение конечного продукта. В патенте указана лишь процедура выделения, количество же образуемого протеоглюкана (эндополисахарида) не известно, экзополисахарид штамм не образует. Известен штамм- продуцент бета-глюкана (ганодерана) 2. Недостатком данного штамма является использование для его культивирования и получения-1-3-глюкана дорогих питательных сред (6 гидролизата крахмала, 0,2 зародышей пшеницы, 0,3 кукурузного экстракта, питательные соли). Выход эндополисахарида (ганодерана) низкий - 28 г/10 л, т.е. 2,8 г/л питательной среды. Образует ли штамм экзополисахарид и в каком количестве не указано. 8374 1 2006.08.30 Известна продукция экзополисахаридов глубинным мицелием 3. Штамм образует 8-18 г/л биомассы. Содержание экзополисахаридов в культуральной среде достигает 7-20 г/л. Недостатком штамма является необходимость использования для образования экзополисахаридов очень дорогих питательных сред (глюкоза - 60 г/л, дрожжевой экстракт - 6 г/л, минеральные соли), культивирование ведется в две стадии путем поддержанияна уровне 2-6. Образует ли штамм эндополисахарид (внутриклеточный) и в каких количествах - не известно. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является штамм, способный образовывать сверхпродукцию полисахаридов и ганодериковой кислоты 4. Штамм выращивают на питательных средах, содержащих 35 г/л источника углерода - глюкозы, лактозы, сахарозы или мальтозы, 5 г пептона, 2,5 дрожжевого экстракта, минеральные соли и витамины В 1 - 0,05 г/л. Выход биомассы составляет 10,0-12,3 г/л, при культивировании в ферментерах в течение 8-12 сут. достигает 22 г/л. Выход экзополисахарида - до 1,0 г/л, содержание эндополисахарида - 10,3-12,3 . Продуктивность культуры по экзополисахариду (мг/л в сут.) - 52,060,0, по эндополисахариду (мг/л сут.) - 142,0. Продукция при выращиваниив ферментере на 18-20 сутки экзополисахарид - 0,8 г/л, эндополисахарид - 2,2 г/л. Данный штамм взят за прототип. Однако штамм характеризуется недостаточно высокой физиологической активностью и продуктивностью. Недостатками данного штамма являются низкое образование экзополисахаридов (до 0,6-0,8 г/л),низкое образование эндополисахаридов (до 13,0 либо 2,2 г/л),низкая продуктивность штамма по экзополисахаридам (до 60 мг/л в сут.),низкая продуктивность штамма по эндополисахаридам (до 144 мг/л сут.),использование для выращивания штамма сложных дорогостоящих многокомпонентных питательных сред лактоза или другой источник углерода 35-60 г/л (стоимость - 7 тыс/кг),пептон - 5 г/л (стоимость - 92 тыс/кг), минеральные соли. Задачей изобретения является получение штамма, более продуктивного по синтезу полисахаридов (эндо- и экзополисахаридов), а также способностью расти на более широком спектре относительно дешевых и простых по составу питательных средах. Предлагаемый штаммБИМ -325 Д выделен в виде тканевых изолятов коммерческих плодовых тел (фармкультура), получен путем естественной селекции и депонирован в Коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси, коллекция мицелиальных грибов под регистрационным номером БИМ -325 Д. Культура также поддерживается в коллекции мицелиальных грибов лаборатории микологии ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси. Штамм хранится при 4-6 С на сусло-агаре, на сусло-агаре с добавлением 0,5 опилок. Культурально-морфологические свойства. При поверхностном культивировании на сусло-агаре при 27-30 С через 4-5 сут. роста появляются колонии диаметром 40-60 мм, белые с приятным грибным запахом. Колонии гриба на агаризованном сусле кожистые, радиальные, с ярко выраженными концентрическими кругами, край колонии ровный, не приподнятый, на реверзуме наблюдается зональность с темными (темно-коричневыми и светлыми зонами). Мицелий невоздушный,невысокий, плотный, с начала роста белый, затем желто-золотистый, до коричневого. Генеративные гифы септированные, тонкостенные (2-5 мкм в диам.), с пряжками 2-4 мкм. Ростовой коэффициент 45,0-47,2. Скорость роста - 9,0-10,5 мм/сут. Полное зарастание чашки наблюдается к 9 сут. Базидиомы однолетние полукруглые, средних размеров, 2-610-232-3 см, с центральной довольно длинной ножкой. Ножка цилиндрическая, 2-4 см в диам. 5-10 см. Верхняя поверхность мягко изгибается, с блестящей, оранжево-красной корой, часто покрыта коричневого цвета какао спорами. Поверхность пор кремовая или желтовато-белая,2 8374 1 2006.08.30 после периода активного роста - коричневатая. Поры 4-6 на 1 мм. На срезе корка красновато-коричневая, хорошо различима и на ножке и на шляпке, 1 мм толщиной контекст кремово-белый, мягко-пробковый, трубочки серовато-белые толщина шляпки при основании 1,5-2,5 см. Гифальная система тримитическая, гифы с пряжками, бесцветные, споры яйцевидные, коричневые, 7-116-8 мкм. Растет на широколиственных деревьях (и т.д.), иногда на ели, наиболее часто встречается на больших пнях. Факторы, влияющие на образование плодовых тел температура 21-27 С. Освещение 50-200 люкс. Оптимальная среда сусло-агар. Среда на основе молочной сыворотки 3 ,24 - 0,5 , дрожжевой экстракт - 0,1 . Пивное сусло, 8 Б. Исходныйсреды 5,5-6,0, в процессе культивирования снижается до 3,5-4,0. Штамм не является зоо- и фитопатогенным. Физиолого-биохимические признаки. Аэроб. Растет при температуре 25-30 С. Оптимум 5,0-6,0. Отношение к источникам углерода ассимилирует глюкозу, лактозу, арабинозу, ксилозу,галактозу, маннозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу, маннит, сорбит, крахмал, целлюлозу. Отношение к источникам азота использует пептон, аспарагин, аммоний сернокислый,дрожжевой и кукурузный экстракт, дрожжевой автолизат. Токсикологические исследования штамма (глубинного и поверхностного мицелия) проводились на лабораторных животных крысы, беспородные белые мыши, морские свинки, кролики. Установлено, что сам штамм и мицелий не обладают кумулятивными свойствами, в условиях повторного внутрижелудочного введения в массивных дозах не способны к формированию токсических факторов, приводящих к нарушению жизнедеятельности отдельных органов, систем и организма в целом. Не обладают раздражающим и общерезорбтивным действием, не обладают сенсибилизирующей активностью и не представляют опасности аллергенного поражения, не обладают кожным ирритативным и кожно-раздражающим действием. Не выявлены функциональные и структурные нарушения со стороны жизненно важных систем организма. Проведенные исследования позволяют сделать заключение о безвредности гриба для организма. На модели окисления линолевой кислоты установлена высокая антиоксидантная активность глубинного и поверхностного мицелия (до 90 и выше по отношению к ионолу- известному антиоксиданту). Спиртовые экстракты подавляли автоокисление линолевой кислоты и образование продуктов перекисного окисления, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой. Сведения, подтверждающие образование полисахаридов и других компонентов штаммомБИМ -325 Д на различных питательных средах Пример 1. Культуру грибаБИМ -325 Д выращивают на скошенном суслоагаре при 25-30 С в течение 5-7 сут., затем переносят культуру стерильной лопаткой или шпателем в качалочные колбы вместимостью 1 л с 300 мл стерильной среды - пивное неохмеленное сусло 5 Б,среды 5,5-6,0. Штамм культивируют на качалке (160-180 об/мин) при 28-30 С в течение 6-7 сут. Полученный мицелий фильтруется, промывается водой и сушится в токе теплого воздуха при температуре не выше 60 С. В культуральной жидкости и полученном мицелии определяют содержание экзо- и эндополисахаридов, другие показатели биомасса, г/л 27,0 эндополисахарид,17,5 эндополисахарид, г/л 4,8 экзополисахарид, г/л 23,0 продуктивность штамма по эндополисахариду, мг/л сут. 685,7 3 8374 1 2006.08.30 продуктивность штамма по экзополисахариду, мг/л сут. 3285,7 липиды,12,0 линолевая кислота,72,0 фенольные соединения, мг/1750,0 антиоксидантная активность,90,8. Использование предложенного штамма позволило увеличить по сравнению с прототипом эндополисахариды - на 34,6 либо в 2,2 раза экзополисахариды - в 28,7 раза продуктивность по эндополисахаридам - почти в 5 раз продуктивность по экзополисахаридам - в 55 раз. Пример 2. Выращивание гриба осуществляется аналогично изложенному в примере 1. В качестве питательной среды используется сухая молочная сыворотка - 50 г/л, (4)2 О 4 - 2,0 г/л,дрожжевой экстракт - 1,0 г/л, вода водопроводная - остальное,- 5,5-6,0. Показатели биомасса, г/л 25,0 эндополисахарид,16,0 эндополисахарид, г/л 4,0 экзополисахарид, г/л 18,0 продуктивность штамма по эндополисахариду, мг/л сут. 571,4 продуктивность штамма по экзополисахариду, мг/л сут. 2571,4 липиды,11,0 линолевая кислота,68,2 фенольные соединения, мг/1500,0 антиоксидантная активность,88,0. Использование предложенного штамма позволило увеличить по сравнению с прототипом эндополисахариды - на 23,0 либо в 1,8 раза экзополисахариды - в 22,5 раза продуктивность по эндополисахаридам - в 4 раза продуктивность по экзополисахаридам - в 42,8 раза. Пример 3. Выращивание гриба осуществляется аналогично изложенному в примерах 1, 2. В качестве питательной среды используется минеральная среда с лактозой лактоза - 30,0 г/л,(4)24 - 1,4 г/л, КН 2 РО 4 - 1,0 г/л, кукурузный экстракт - 2,0 г/л, вода водопроводная до 1 л,- 5,5-6,0. Показатели биомасса, г/л 22,0 эндополисахарид,16,8 эндополисахарид, г/л 3,7 экзополисахарид, г/л 16,5 продуктивность штамма по эндополисахариду, мг/л сут. 528,0 продуктивность штамма по экзополисахариду, мг/л сут. 2357,1 липиды,12,7 линолевая кислота,65,3 фенольные соединения, мг/1620,0 антиоксидантная активность,90,0. Использование предложенного штамма позволило увеличить по сравнению с прототипом 4 8374 1 2006.08.30 эндополисахариды - на 29,0 либо в 1,7 раза экзополисахариды - в 20,6 раза продуктивность по эндополисахаридам - почти в 3,7 раза продуктивность по экзополисахаридам - в 39,3 раза. Пример 4. Выращивание гриба осуществляется аналогично изложенному в примерах 1-3. В качестве питательной среды используется минеральная среда с мелассой меласса - 30,0 г/л,(4)24 - 2,0 г/л, КН 2 РО 4 - 1,0 г/л, кукурузный экстракт - 1,5 г/л, вода водопроводная до 1 л,- 5,5-6,0. Показатели биомасса, г/л 23,0 эндополисахарид,17,6 эндополисахарид, г/л 4,0 экзополисахарид, г/л 20,0 продуктивность штамма по эндополисахариду, мг/л сут. 571,6 продуктивность штамма по экзополисахариду, мг/л сут. 2857,0 липиды,11,2 линолевая кислота,63,8 фенольные соединения, мг/1370,0 антиоксидантная активность,94,0 Использование предложенного штамма позволило увеличить по сравнению с прототипом эндополисахариды - на 35,0 либо в 1,8 раза экзополисахариды - в 25,0 раз продуктивность по эндополисахаридам - почти в 4 раза продуктивность по экзополисахаридам - в 47,6 раза. Пример 5. Выращивание гриба осуществляется аналогично изложенному в примерах 1-4. Выращенный в колбах мицелий стерильно переносят в ферментер объемом 10 л с 7 л любой (по пп. 1-4) питательной среды. Культивирование ведется при аэрации 0,5 л воздуха, /л среды/мин, температуре 28-30 С. Длительность культивирования - 72-96 ч. Показатели биомасса, г/л 22,0-25,0 эндополисахарид,16,5-17,5 эндополисахарид, г/л 3,5-4,4 экзополисахарид, г/л 17,0-23,0 продуктивность штамма по эндополисахариду, мг/л сут. 875,0-1100,0 продуктивность штамма по экзополисахариду, мг/л сут. 4250,0-5750,0 липиды,11,5-12,0 линолевая кислота,65,0-72,0 фенольные соединения, мг/1500,0-1700,0 антиоксидантная активность,90,0-94,0. Использование предложенного штамма позволило увеличить по сравнению с прототипом эндополисахариды - на 27,0-34,6 либо в 1,6-2 раза экзополисахариды - в 21,0-28,0 раз продуктивность по эндополисахаридам - в 6-7,6 раза продуктивность по экзополисахаридам - в 70-95 раз. 8374 1 2006.08.30 Таким образом, предлагаемый штамм имеет более высокую физиологическую активность, характеризуется сверхвысоким уровнем синтеза экзо- и эндополисахаридов, высокой продуктивностью по этим показателям. Предлагаемый новый штамм Эндополисахарид - 16,0-17,6 либо 3,5-4,8 г/л Экзополисахарид - 16,5-23,0 г/л Продуктивность по эндополисахариду 528,6-1100,0 мг/л сут. Продуктивность по экзополисахариду,мг/л сут. - 4250,0-5750,0 Существенно и то, что у штамма обнаружены неизвестные ранее для грибов родасвойства - высокая антиоксидантная активность, способность синтезировать значительное количество фенольных соединений - натуральных антиоксидантов, образовывать большое количество липидов с высоким содержанием (до 72 ) непредельной линолевой кислоты. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6