Штамм бактерий Corynebacterium glutamicum АС-L – продуцент L-лейцина

(12) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физико-органической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Якимович Николай НиколаевичГринько Вячеслав Николаевич Якимович Ирина ВасильевнаЧаевский Сергей ИвановичМузыченко Леонид АфанасьевичГусельникова Татьяна Владимировна Куваева Зоя ИвановнаИванов Юлиан Григорьевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физико-органической химии Национальной академии наук Беларуси(56)3668073, 1972.3865690, 1975.3970519, 1976.5763231 , 1998.5705370 , 1998.2059726 1, 1996. Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий - продуцента незаменимой аминокислоты -лейцина, которую используют в фармацевтической промышленности, медицине, в качестве добавки в пищевые продукты и в корма животным, а также в качестве компонента питательных сред при выращивании определенных видов микроорганизмов. Известны ауксотрофные мутанты и прототрофы, устойчивые к аналогам лейцина, которые способны накапливать в ферментационной среде до 11-16 г/л лейцина 1-3. Наиболее высокий уровень биосинтеза лейцина (34,0 г/л) обеспечивает штамм- аналогорезистентный и ауксотрофный по изолейцину и метионину 4. Для достижения высоких показателей биосинтеза лейцина штаммнуждается в дорогостоящем источнике углеродного питания - глюкозе. При замене глюкозы на мелассу активность продуцента снижается до 15,8 г/л лейцина 5. 6679 1 Недостатком штаммаявляется то, что при использовании в составе питательной среды относительно дешевого источника углеродного питания,- мелассы, вместо глюкозы, биосинтетическая активность продуцента значительно снижается. Кроме этого, продуценту необходимо присутствие в питательной среде дефицитных аминокислот - изолейцина и метионина. Наиболее близким к изобретению является штамм-продуцент -лейцина. ВНИИ генетика - 127 6, который способен накапливать в ферментационной среде 23,7 г/л лейцина при использовании питательных сред, содержащих мелассу. Для роста и максимального накопления лейцина штамм нуждается в тиамине и биотине. Необходимо отметить, что уровень накопления лейцина в ферментационной среде данным продуцентом недостаточно высокий. Задачей изобретения является создание нового штамма бактерий, продуцирующего лейцина в высоких концентрациях независимо от присутствия в составе питательных сред сложного по химическому составу источника углеродного питания - мелассы, или простого химически чистого источника углерода, например сахарозы (сахара-песка). Для получения нового штамма использовали продуцент -лизинаТ-3 (Т-3), ауксотрофный по гомосерину или треонину и метионину. На первом этапе от исходного штамма Т-3 были отобраны спонтанные мутанты устойчивые к -(2 аминоэтил)цистеинув концентрации 2 мг/мл. Отобранные колонии выращивали в мясопептонном бульоне, в логарифмической фазе роста отмывали от среды ацетатным буфером, ресуспендировали в том же буфере, содержащим 500 мкг/мл -метилнитро-нитрозогуанидина и инкубировали 15 мин при 37 С в водяной бане. Мутагенизированную культуру дважды отмывали ацетатным буфером и высевали на чашки с минимальной средой состава, (г/л) глюкоза - 20,0 аммоний сернокислый - 10,0 калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,0 мочевина - 2,5 магний сернокислый семиводный - 0,05 марганец сернокислый четырехводный - 0,01 мг железо сернокислое семиводное - 0,01 мг биотин 0,1 мг тиамин - 0,4 мг агар-агар - 20 вода дистиллированная - остальное рН - 7,0-7,2. В минимальную среду добавляли аналог лейцина , - 4 гидроксилейцин (Г) в концентрации 4 мг/мл. Через трое суток отбирали полученные колонии и проверяли на лейцинпродуцирующую способность ферментацией с использованием питательных сред, содержащих в качестве источников углеводов мелассу или сахар-песок. Ферментации проводили в колбах Эрленмейера объемом 750 см 3, в которые вносили по 15 см 3 питательных сред. Скорость вращения качалки 250 об/мин, температура 311,0 С, время ферментации 72-96 ч. Посевной материал вносили в колбы в виде суспензии клеток, выращенных на косяках с МПА в течение 24 ч при 311,0 С. Содержание лейцина в культуральной жидкости определяли с помощью тонкослойной хроматографии с последующим окрашиванием нингидрином,элюированием и определением интенсивности окрашивания на фотоэлектроколориметре. Отобранный таким образом мутант АС-71 в указанных условиях синтезировал в ферментационную среду при биосинтезе на питательной среде, содержащей мелассу 18,2 г/л лейцина, и на среде с сахаром-песком - 13,6 г/л лейцина. Далее для повышения лейцинпродуцирующей активности мутант-71 был обработан ультрафиолетовыми лучами по следующей схеме. Культуру продуцента в логарифмической фазе роста отмывали от среды центрифугированием и ресуспендированием в физиологическом растворе. Суспензию клеток разливали по 2 мл в чашки Петри диаметром 5 см и облучали под лампой УФ-ПРК-4. Интенсивность облучения 60 Дж/м 2. Выживаемость составляла порядка 3 . Облученную культуру центрифугировали, ресуспендировали в мясопептонном бульоне и инкубировали в течение 8 ч на качалке. Далее культуру вновь отмывали от бульона физиологическим раствором, соответствующие разведения культуры высевали на чашки с мясопептонным агаром и выращивали в течение трех суток при температуре 311,0 С. 2 6679 1 Полученные колонии проверяли на приобретение признака АЕЦ- и ГОКЛ-устойчивости. После проверки отобранных колоний на способность к накоплению лейцина был выделен штамм- . Проведено депонирование полученного штамма в коллекции культур микроорганизмов Белорусского государственного университета. Штамм депонирован под порядковым номером В 1011. Штамм- КМБУ В 1011 имеет следующие характеристики Культурально-морфологические признаки Клетки овальные, размером 0,5-1,0 мкм, спор не образуют, неподвижные, грамположительные. При росте на мясопептонном бульоне штамм образует равномерную интенсивную суспензию без формирования видимого осадка и пленки на поверхности жидкости. Через 3-5 суток роста при 30 С на мясопептонном агаре и на минимальной агаризованной среде, содержащей биотин и тиамин, колонии диаметром 0,5-1,5 мм, светлокремовые, поверхность гладкая, форма выпуклая, край ровный. Физиолого-биохимические признаки. Отношение к источникам углерода. Использует глюкозу, мальтозу, сахарозу, фруктозу. Отношение к источникам азота. Использует аммонийный азот, мочевину, аминокислоты. Для роста нуждается в биотине, тиамине, устойчив к АЕЦ и ГОКЛ. Рост возможен в диапазоне 5-35 С, оптимум - 29-31 С. Оптимум рН для роста 6,8-7,2. Штамм хранится в столбиках полужидкого мясопептонного агара под слоем вазелинового масла в течение 4-6 месяцев или в лиофильно высушенных ампулах в течение 1 года. Получение лейцина с использованием штаммаКМБУ В 1011 осуществляют следующим образом. Пример 1. Культурой штамма- засевают пробирки со скошенным мясопептонным агаром и выращивают в термостате при 30 С в течение 24 ч. Затем культуру смывают стерильным физиологическим раствором и засевают колбы объемом 750 см 3, содержащие 50 см 3 посевной среды. Состав посевной среды, (г/л) сахар-песок - 50,0 кукурузный экстракт - 60,0 сернокислый аммоний - 15,0 мел - 15,0 вода водопроводная питьевая - остальное, рН среды до стерилизации 7,5-7,7. Колбы устанавливают на круговую качалку (250 об/мин) и инкубируют в течение 20-24 ч при температуре 311,0 С. Выращенный посевной материал в количестве 200 см 3 вносят в лабораторный ферментер вместимостью 5,0 дм 3, содержащий 1,8 дм 3 ферментационной среды следующего состава,(г/л) сахар-песок - 130,0 кукурузный экстракт - 18,0 сернокислый аммоний - 15,0 калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,5 сернокислый магний семиводный - 0,5 дестиобиотин - 200 мкг тиамин - 600 мкг р - 7,2. Ферментацию проводят при перемешивании и аэрации ферментационной среды воздухом, температуре 311,0 С, рН 7,2-7,4. Пеногаситель (пропинол Б-400) задают в ферментатор по мере вспенивания среды, рН поддерживают автоматически, подавая по сигналу датчика рН 25 -ный раствор аммиака. С помощью датчика замеряют содержание кислорода воздуха в ферментационной среде вот насыщения и поддерживают его значение на уровне 15-20 путем регулирования оборотов мешалки и количеством воздуха, подаваемого на аэрацию. В процессе ферментации при остаточном содержании редуцирующих веществ в ферментационной среде в пределах 1,5-3,0 в ферментатор с помощью перистальтического насоса непрерывно подают питательную среду следующего состава, (г/л) сахар-песок 600,0 кукурузный экстракт - 25,0 сернокислый магний семиводный - 2,0 калий фосфорнокислый двухзамещенный - 6,5 тиамин - 400 мкг дестиобиотин - 150 мкг рН - 7,6. 3 6679 1 Питательную среду подают со скоростью, обеспечивающей содержание редуцирующих веществ в ферментационной среде на уровне 0,8-1,5 . Через 60-65 ч биосинтеза концентрация -лейцина достигает 34,5 г/л. Пример 2. Выращивание посевного материала и процесс биосинтеза лейцина проводят аналогично примеру 1 при следующих составах начальной и подпиточной питательных сред. Состав начальной питательной среды, (г/л) сахар-песок - 130,0 сернокислый аммоний 15,0 калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,5 сернокислый магний семиводный 0,2 дестиобиотин - 0,4 мг тиамин - 0,8 мг рН - 7,2. Состав подпиточной среды, (г/л) сахар-песок - 600,0 дестиобиотин - 1,5 мг тиамин 1,5 мг вода водопроводная питьевая - остальное рН - естественный. Через 55-60 ч биосинтеза концентрация лейцина составляет 35,0 г/л. Пример 3. Выращивание посевного материала проводят аналогично примеру 1 при использовании посевной среды следующего состава, (г/л) меласса - 100 кукурузный экстракт - 40 сернокислый аммоний - 15 мел -15 рН после стерилизации - 7,2. Процесс биосинтеза лейцина проводят аналогично примеру 1 при следующем составе питательной среды, (г/л) меласса - 225,0 сернокислый аммоний - 25,0 калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,0 сернокислый магний семиводный - 1,0 дестиобиотин 200 мкг тиамин - 600 мкг рН после стерилизации - 7,2. Состав подпиточной питательной среды, (г/л) меласса - 700 дестиобиотин - 200 мкг тиамин - 600 мкг рН после стерилизации - 7,4. Через 60-65 ч ферментации концентрация лейцина составляет 33,5 г/л. Штамм- КМБУ В 1011 по сравнению со штаммом. ВНИИ генетика - 127 имеет более высокий уровень активности при использовании питательных сред, содержащих мелассу (в среднем на 30 ). Вместе с тем новый штамм способен продуцировать -лейцин в высоких концентрациях и на питательных средах, содержащих чистые углеводы, например сахарозу (сахар-песок). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.