Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая препроинсулин человека и штамм Escherichia coli XLI-Blue/pInsR-продуцент препроинсулина

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ ПРЕПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА И ШТАММ/ - ПРОДУЦЕНТ ПРЕПРОИНСУЛИНА(71) Заявитель Закрытое акционерное общество Фосфосорб(73) Патентообладатель Закрытое акционерное общество Фосфосорб(57) 1. Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая препроинсулин человека, полученная на основе плазмиды рКК 223-3, в которой проинсулин связан через аргинин, отличающаяся тем, что проинсулин связан через аргинин с естественной лидерной последовательностью и первичная структура полученного препроинсулина имеет следующий вид Изобретение относится к области генной инженерии, микробиологии и медицины и может быть использовано для создания лекарств. Инсулин - гормон поджелудочной железы, недостаток которого приводит к тяжелому заболеванию сахарному диабету. Поэтому на протяжении многих лет предпринимаются попытки разработать высокоэффективные технологии получения инсулина. Поскольку использование инсулина животного происхождения дает целый ряд побочных эффектов, уже более 20 лет проводятся работы в области генной инженерии с целью биотехнологического получения человеческого гормона. 3617 1 Известно, что инсулин синтезируется в виде так называемого препроинсулина и включает в себя лидерную последовательность и три участка, называемые как А, В и С-цепи. Собственно инсулин, как биологически активное соединение, - это небольшой глобулярный белок, в котором А и В цепи связаны дисульфидными связями. В процессе созревания происходит вырезание С-цепи, расположенной между А и В цепями(Биохимия человека. Под редакцией Р. Марри, М., Мир, том 2, стр. 249-250, 1993). Все усилия последних 25-30 лет направлены на решения двух задач в чем экспрессировать белок и какая конструкция препроинсулина оптимальна для биотехнологического использования. Дилемма для решения первой задачи заключается в том, чтобы выбрать либо интра-, либо экстрацеллюлярный путь продукции инсулина. Был испытан каждый из путей, однако принципиальной разницы, дающей неоспоримое преимущество тому или иному подходу, дано не было. Так, и тот и другой вариант не давал преимуществ в устойчивости к протеолизу ( .-Н., . .81, 4627-4631, 1984.. . . 14, 336-346, 1991). И хотя путь получения секретируемого белка сокращал число технологических стадий получения препроинсулина, путь через тельца включения при использовании в качестве микроорганизма продуцента . давал большой выход. Кроме того, надо отметить, что основной недостаток при использовании последнего подхода - денатурации белка при его гиперпродукции - успешно решается для инсулина. Вторая проблема - проблема конструкции препроинсулина. Попытки получить мини-С-проинсулин, где С-цепь была редуцирована до нескольких аминокислот, являющихся местом атаки для трипсина, не принесли удовлетворительных результатов ( . 16, 63-71, 1981). Это, видимо, связано с тем, что Сучасток полипептидной цепи необходим для правильного замыкания дисульфидных связей между цепями А и В. Поэтому в качестве основной конструкции во всех последующих работах был взят целый препроинсулин человека. Полный препроинсулин был получен двумя путями через синтез к ДНК (Ве 11 .,284, 26-32, 1980) и путем химико-ферментативного синтеза ( ..,17, 279-289, 1982 Овчинников Ю.А. и др. Докл. АН СССР 270, 743-747, 1983). Следующая проблема заключалась в том, какую технологию выбрать для получения конечного продукта - инсулина из его предшественника. И если в процедуре расщепления комплекса А, В и С цепей сомнений не было - это обработка трипсином и карбосипептидазой В, то в отношении отщепления лидерной последовательности можно идти двумя путями. Первый - ничего не изменяя, воспользоваться уникальностью первичной структуры препроинсулина - наличием метионина только между лидерной частью и проинсулином, с помощью бромциана расщепить полипептидную цепь ( . . . . . 413,231, 1983). Основной недостаток такого подхода - использование высокотоксичного соединения. Другое направление - создание искусственного линкера между лидерной последовательностью и проинсулином, который можно было бы легко разрезать, например, трипсином. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предложенному изобретению является рекомбинантная плазмидная ДНК, содержащая трипсин-чувствительный участок - аргинин между -связывающим доменом и проинсулином ( .., -С . . . . 236, 656-661, 1996). Необходимость введения-связывающего домена продиктована основной задачей, поставленной авторами, - усовершенствование выделения инсулина и пептида С, который, по их мнению, также имеет выраженную биологическую активность. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предложенному штамму является штамм Е.017, продуцирующий препроинсулин человека (.,-. . 1996, 48, 41-50). Однако известная конструкция является сложной, а технология выделения и очистки инсулина при использовании штамма Е.017 довольно дорогой. Однозначного ответа о целесообразности такого усложнения конструкции гибридного белка пока дать нельзя. Задачей настоящего изобретения является создание плазмиды, с помощью которой синтезируется гибридный белок, лидерный пептид которого связан с проинсулином через остаток аргинина, что позволит отказаться от использования высокотоксичного соединения при получении инсулина, сократить число стадий и упростить процедуру его получения. Другой задачей является создание штамма, продуцирующего препроинсулин с высоким выходом. Поставленная задача решается путем создания плазмиды, названной нами , полученной на основе плазмиды рКК 223-3, в которой проинсулин связан через аргинин с естественной лидерной последовательностью и имеющую нуклеотидную последовательность, приведенную на фиг. 1. Фиг. 1. Участок нуклеотидной последовательности плазмиды , соответствующей гену рекомбинантного белка препроинсулина человека. Место проведения точечной замены подчеркнуто жирным шрифтом. Поставленная задача решается также созданием штамма . 1-/ - продуцента препроинсулина, характеризующегося наличием рекомбинантной плазмидной ДНК . Пример 1. Способ конструирования плазмиды заключается в том, что в плазмиду рКК 223-3 между сайтами рестрикцииибыла помещена к ДНК, кодирующую препроинсулин человека. Далее была проведена замена триплета, кодирующего метионин, на триплет, кодирующий аргинин. С этой целью на первом этапе по сайтам рестрикциии , входящим в последовательность, кодирующую гибридный белок, проводили ферментативный гидролиз. Точечную замену метионина на аргинин проводили с использованием следующих олигонуклеотидов 5 3,5 3. После лигирования по сайтам рестрикцииибыл проведен отбор плазмид, содержащих точечные мутанты. Полная нуклеотидная последовательность плазмиды, кодирующей гибридный белок, приведена на фиг. 2. Фиг. 2.Нуклеотидная последовательность плазмиды . Штамм-продуцент-/ характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные. Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. На агаре Дифко клетки образуют круглые гладкие колонии с ровными краями. При росте в жидкой питательной среде образуют интенсивную ровную муть. Физико-химические признаки. Клетки растут в температурном диапазоне от 8 до 40 С, оптимум рН от 6,8 до 7,0. В качестве источников азота, углерода и других необходимых компонентов используются минеральные соли, казеин, пептон, дрожжевой автолизат и т.д. Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к тетрациклину и ампициллину. Штамм-продуцент . -/ отличается от штамма-реципиента . - наличием рекомбинантной плазмидной ДНК , которая придает дополнительную устойчивость к ампициллину. Клетки . -/ являются продуцентом препроинсулина. При индукции изопропил-бета-тиогалактозидом происходит интенсивный синтез данного белка, который накапливается в виде телец включения. Выход препроинсулина составляет более 30 от суммарного белка клеток. 3617 1 Пример 2. Для получения штамма-продуцента проводят трансформацию штамма . -, используя полученную нами плазмиду , нуклеотидная последовательность которой представлена на фиг. 2. Отобранные клетки, несущие плазмиду , являются продуцентом препроинсулина. На следующем этапе проводят выращивание биомассы в необходимом количестве. Для контроля за динамикой роста культуры пробы периодически отбирают и контролируют. За несколько часов (в зависимости от объема ферментера) до окончания процесса наработки культуры вносят индуктор. Процесс выделения и очистки инсулина ведут следующим образом. После завершения процесса ферментации суспензию клеток центрифугируют. Отобранные клетки разрушают. Далее рекомбинантный белок подвергается реакции сульфитолиза с образованием рекомбинантного белкасульфоната. Данный этап позволяет стабилизировать белок и эффективно проводить его выделение и очистку с помощью анионообменной хроматографии за счет появления 6 отрицательно заряженных групп О 3. Затем рекомбинантный белоксульфонат подвергают обессоливанию на колонке с Сефадексом -25 и ренатурации в разбавленном растворе с помощью 2-меркаптоэтанола. Очищенный ренатурированный рекомбинантный белок подвергают трипсинолизу. Поскольку основными продуктами трипсинолиза являются диинсулин и -инсулин, дальнейшее превращение их в инсулин проводят с использованием карбоксипептидазы В. Таким образом ренатурированный рекомбинантный белок может непосредственно превращаться в инсулин, минуя стадию получения проинсулина. Именно это позволяет исключить в технологической схеме стадию расщепления рекомбинантного белка бромцианом, которая необходима для получения проинсулина из нативного препроинсулина. Исключение из технологической схемы стадии, связанной с бромцианом, не только уменьшает себестоимость конечного продукта за счет непосредственного сокращения числа стадий, но и значительно снижает вредность данного производства. Кроме того, замена химического расщепления рекомбинантного белка на ферментативное является очень выгодной, так как обеспечивает более высокий выход и качество конечного продукта. После ферментативной обработки ренатурированного рекомбинантного белка трипсином и карбоксипептидазой В, выделение и очистку инсулина проводят с использованием катионообменной хроматографии. Фракции с высоким содержанием инсулина объединяют и концентрируют на ультрафильтрационной установке. Заключительную очистку инсулина проводят с помощью гель-фильтрации. Фракции с инсулином лиофилизуют. Биологическая активность полученного инсулина составила 29 Ед/мг. Молекулярную массу полученного инсулина определяют с помощью масс-спектрометрии. -концевую последовательность (9 шагов) полученной субстанции определяли с помощью метода Сэнгера. Анализ аминокислотных последовательностей показал наличие только двух полипептидных цепей, принадлежащих инсулину. Таким образом, предлагаемое изобретение имеет следующие преимущества во-первых, плазмидакодирует синтез гибридного белка, в котором лидерный пептид и проинсулин соединены через остаток аргинина. Во-вторых, последовательность гибридного белка находится под сильным промотором, что обеспечивает ей высокий уровень экспрессии в штамме-продуценте. В третьих, исключение стадии бромцианового гидролиза при получении инсулина позволит не только отказаться от использования токсичного соединения, но и сократить технологическую цепочку, что в свою очередь приведет к снижению себестоимости конечного продукта. В четвертых, предлагаемая конструкция не содержит в отличие от прототипа дополнительной -связывающей последовательности. Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66. 6