Способ получения ржано-пшеничной хромосомно-замещенной формы секалотритикум

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Гордей Иван Андреевич Хохлова Светлана Алексеевна Быченко Анна Петровна Люсиков Олег Михайлович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(56) ЩАПОВА А.И. и др. Цитогенетика пшенично-ржаных гибридов. - Новосибирск Наука, 1990. - С. 34-67. ГОРДЕЙ И.А. и др. Известия Национальной академии наук Беларуси Серия биологических наук. - 1999. -2. С. 39-42.1391547 1, 1988.(57) Способ получения ржано-пшеничной ///-хромосомно-замещенной формы секалотритикум, при котором скрещивают тетраплоидную рожь (, 2428) с гексаплоидным тритикале (, 2642) и полученные ржано-тритикальные диплогаплоиды 1 (, 535) в качестве материнской формы скрещивают с мягкой пшеницей (, 2642), отбирают фертильные гексаплоиды в самоопыляемом потомстве полученных гибридов и идентифицируют полученную ///-хромосомнозамещенную форму с применением С-метода дифференциального окрашивания хромосом. 11442 1 2008.12.30 Изобретение относится к биотехнологии, хромосомной инженерии, в частности к генетике и селекции растений, и предназначено для создания ржано-пшеничных хромосомно-замещенных гексаплоидных форм секалотритикум (, 26 х 42) для применения в селекции зерновых культур. Известные методы создания хромосомно-замещенных форм основываются на использовании трех типов промежуточных продуктов гибридизации анеуплоидов (формы с числом хромосом, не кратным гаплоидному набору),секвидиплоидов (гибриды, имеющие разные геномы в гаплоидном и диплоидном состоянии),полигаплоидов (гибриды, имеющие разные геномы в гаплоидном состоянии). В связи с кариотипическими и цитогенетическими отличиями промежуточных продуктов эти методы различаются эффективностью, контролируемостью и спектром замещений хромосом 1. Использование гибридизации между анеуплоидами позволяет проводить замещения конкретных хромосом, однако трудоемкость создания и сохранения анеуплоидов ограничивает спектр получаемых замещений. В практической селекции наиболее часто применяются методы, включающие в качестве промежутого этапа получение секвидиплоидов и полигаплоидов. Недостатком использования секвидиплоидов для получения замещений, при достаточно высоком выходе конечного материала, является узость спектра получаемых замещений - в пределах гаплоидных геномов. К предлагаемому изобретению наиболее близок способ получения ///-пшенично-ржаных хромосомно-замещенных форм пшеницы и тритикале в самоопыляемом потомстве от скрещиваний пшенично-ржаных полигаплоидов 1 с эуплоидными формами пшеницы или тритикале (, )(фиг. 1). Однако, при возможности получения всего спектра межгеномных замещений хромосом, на практике эффективность этого метода ограничивается очень низкой фертильностью полигаплоидов 1 и генетическим грузом аномальности мейоза. При жестком отборе гамет на жизнеспособность это сужает спектр получаемых замещений. Поэтому метод практически не используется для получения межгеномных замещений хромосом 1. В отличие от полигаплоидов, используемые в предложенном методе диплогаплоиды имеют повышенную фертильность и ненарушенный мейоз, что определяет высокую эффективность метода. Цель изобретения - повышение эффективности создания ржано-пшеничных хромосомно-замещенных форм секалотритикум и расширение спектра межгеномных замещений хромосом пшеницы и ржи. Предлагаемое техническое решение включает следующие этапы (фиг. 2) 1) получение ржано-тритикальных гибридов 1 (, 5 х 35) путем гибридизации сортов тетраплоидной ржи (, 2 4 х 28) и гексаплоидных тритикале (,2642) 2) скрещивание ржано-тритикальных гибридов 1 в качестве материнской формы с сортами мягкой пшеницы (, 2642) 3) отбор по цитологическим и морфологическим признакам и самоопыление в течение двух поколений 42-хромосомных фертильных стабильных форм с пшенично-ржаными замещениями хромосом 4) хромосомная идентификация замещений с использованием метода дифференциального окрашивания хромосом (-). Отличительной особенностью предлагаемого способа получения ржано-пшеничной хромосомно-замещенной формы является возможность использования ржано-тритикальных диплогаплоидов (гибриды, имеющие геномы в диплоидном и гаплоидном состоянии) 1(, 5 х 35), способных с высокой частотой формировать функциональные гаметы различного геномного и хромосомного состава. Применение предлагаемого метода дает возможность получения ржано-пшеничных хромосомно-замещенных форм секалотритикум на наиболее хозяйственно оптимальном уровне плоидности - гексаплоидном 11442 1 2008.12.30 на цитоплазме ржи, несущей ценные признаки адаптивности и болезнеустойчивости с использованием разнообразного генофонда сортов тетраплоидной ржи, гексаплоидных тритикале и пшеницы с различными типами и полным спектром межгеномных замещений хромосом(///) в сочетании с высокой рекомбинационной изменчивостью и хромосомными перестройками с высокой эффективностью использования диплогаплоидов для получения хромосомно-замещенных форм уже во 2-4-м скрещиваниях. Эффективность использования приведенной выше схемы подтверждается результатами проведенных исследований. На первом этапе гибридизации достигается выход жизнеспособных гибридов 1 с частотой в среднем 1,5 и до 12 на отдельных растениях (табл. 1) в результате использования тетраплоидных форм ржи (, 228), обеспечивающих высокую скрещиваемость и постгамную совместимость, и гексаплоидных тритикале (, 242) в качестве вида-посредника для интродукции геномов пшеницы, позволяющего преодолеть реакцию односторонней несовместимости ржи с пшеницей 2. Фертильность пыльцы и колоса полученных диплогаплоидов 1 составила в среднем 10,5 и 5,7 соответственно, превышая 40 у отдельных растений (табл. 2). Цитологический анализ полученных амфиплоидов показал, что число хромосом в гаметах растений 1 варьировало в пределах от 14 до 28. Выход 42-хромосомных амфиплоидов составил в среднем 25 и достигал 50 в зависимости от комбинации скрещивания(табл. 3). Фертильность пыльцы и колоса 42-хромосомных амфиплоидов варьировалась в пределах 0-80 , изменяясь скачкообразно - 5 , 25 и 75- в связи с используемым в гибридизации генотипом исходного сорта ржи (табл. 4). С целью получения ///хромосомно-замещенных форм проводили скрещивание 42-хромосомных ржано-тритикальных гибридов 1 с мягкой пшеницей (, 6 х 42). Гибридные зерновки высевали в поле семьями (потомство одного колоса). Практически все полученные линии с фертильностью 25-50 содержали межгеномные замещения хромосом пшеницы и ржи. Хромосомно-замещенные линии идентифицировали по показателям цитологической и морфологической стабильности. В 3 у них наблюдалась стабилизация мейоза и хромосомной структуры кариотипа. По показателям хозяйственно полезных признаков и морфологических маркеров были выделены гексаплоидные ржано-пшеничные хромосомно-замещенные линии. В поколениях 4-5 у них происходила выраженная цитологическая и морфогенетическая стабилизация. В качестве примера приводится 1 А/1-хромосомно-замещенная линия (Новосибирская х )Луцковлянка, у которой уровень фертильности растений достигал 72(фиг. 3). Растения данной линии характеризовались средней высотой 70-75 см, светлой окраской зерна, зимостойкостью до 100 и устойчивостью к грибным болезням. Использование С-метода дифференциальной окраски хромосом позволило идентифицировать произошедшие пшенично-ржаные замещения. На фиг. 3 представлена метафазная пластинка линии с дифференциально окрашенными хромосомами. На фотографии идентифицированы хромосомы линии и установлено замещение хромосом 1/1. Таким образом, ржано-тритикальные гибриды 1 представляют собой не истинные полигаплоиды, а являются 35-хромосомными диплогаплоидами в 1 со смешанным геномным составом (, 5 х 35 их геном включает диплоидный - и три гаплоидных А-, В-, -набора хромосом). В процессе мейоза у них происходят гомеологичная рекомбинация, хромосомные и геномные перестройки и формируется широкий спектр жизнеспособных гамет, различных по хромосомному и генетическому составу. Специфи 3 11442 1 2008.12.30 ческие особенности геномного и хромосомного состава и мейоза ржано-тритикальных диплогаплоидов 1 обеспечивают присутствие в их гаметах полного -генома, что повышает жизнеспособность различных по хромосомному составу гамет и является генетической основой высокой эффективности предлагаемого способа. Сравнительный анализ параметров эффективности показал, что предлагаемый способ превосходит прототип на 2-3 порядка (табл. 5). В отличие от прототипа, высокая эффективность нашего способа позволяет использовать его в практической селекции - для хромосомной реконструкции геномов хлебных злаков и создания ржано-пшеничных хромосомно-замещенных форм секалотритикум. Таблица 1 Скрещиваемость ди- и тетраплоидной ржи с гексаплоидными тритикале Комбинация скрещивания Изучено клеток фертильных количество Таблица 3 Распределение растений ржано-тритикальных амфиплоидов по числу хромосом Число хромосом 11 растений Максимальное значение фертильности растений амфиплоидов,15,41,14 72,32,00 24,01,35 9,40,58 2,10,64 3,30,56 0,0 0,0 0,0 Таблица 5 Сравнительная характеристика эффективности предлагаемого способа получения ржано-пшеничной хромосомно-замещенной формы с прототипом Щапова А.И., Кравцова Л.А., 1990 Параметры сравнения Эффективность гибридизации исходных форм,Гибриды 1 - промежуточная форма Фертильность гибридов 1,Тип используемых фертильных гамет - чНГ (частично нередуцированные гаметы) и НГ (нередуцированные гаметы) Эффективность скрещивания 1 с пшеницей,Выход 42-49-хромосомных амфиплоидов с нестабильным хромосомным составом,Фертильность амфиплоидов 2-3 при размножении для отбора замещенных форм,Выход хромосомно-замещенных форм,Эффективность ах метода Источники информации 1. Щапова А. И. и др. Цитогенетика пшенично-ржаных гибридов. - Новосибирск Наука, 1990. - С. 34-67. 2. Гордей И.А. и др. Известия Национальной академии наук Беларуси Серия биологических наук. - 1999. -2. - С. 39-42. 3.1391547, 1988. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6