Способ получения фенольных веществ из растительного сырья

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕНОЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(72) Авторы Кузнецова Зинаида Павловна Цыганков Василий Георгиевич Бондарук Алла Михайловна Соколов Сергей Михайлович Левашкевич Антон Леонидович(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(57) Способ получения фенольных веществ из растительного сырья, включающий 3-кратное экстрагирование сырья этанолом, концентрирование объединенных экстрактов путем упаривания под вакуумом при температуре от 50 до 60 С, отделение осадка центрифугированием и выделение фенольных веществ из надосадочной жидкости на полиамидном адсорбенте, отличающийся тем, что в качестве сырья используют высушенные при температуре 15-20 С листья горца сахалинского, а экстрагирование фенольных веществ проводят 72-90 этанолом, причем массовое соотношение сырьеэтанол составляет 15. Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается способов выделения биологически активных веществ, обладающих рядом эффектов, опосредованных Р-витаминной активностью. Известен способ получения флавоноидов, обладающих Р-витаминной активностью,где в качестве растительного сырья используют надземную часть горца Вейриха, экстрагирование проводят 86-96 -ным этиловым спиртом, очистку от балластных веществ проводят с помощью полиамидного адсорбента и центрифугирования при 60-70 тыс.об/мин в течение 20-30 мин. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому 1. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является получение комплекса биологически активных веществ (БАВ) из растительного сырья путем его экстрагирования этанолом, упаривания, очистки с использованием полиамидного адсорбента и центрифугирования. Способ-прототип позволяет получить из указанного растительного сырья только вещества, относящиеся к классу флавонолов. Задачей заявляемого изобретения является расширение сырьевой базы и получение субстанции биологически активных веществ, обладающих антиоксидантной и адаптогенной активностью. 11494 1 2008.12.30 Поставленная задача достигается тем, что предложен способ получения фенольных веществ из растительного сырья, включающий 3-кратное экстрагирование сырья этанолом, концентрирование объединенных экстрактов путем упаривания под вакуумом при температуре от 50 до 60 С, отделение осадка центрифугированием и выделение фенольных веществ из надосадочной жидкости на полиамидном адсорбенте, при этом в качестве сырья используют высушенные при температуре 15-20 С листья горца сахалинского, а экстрагирование фенольных веществ проводят 72-90 этанолом, причем массовое соотношение сырьеэтанол составляет 15. Горец сахалинский является типичным представителем крупнотравья. По внешнему виду он скорее напоминает кустарник, чем травянистое растение, так как его стебли достигают высоты 2,5-4,5 м. Листья широкоовальные, длина 10-30 см, ширина 4,25 см. Достоинство предложенного растения состоит еще и в его экологической продуктивности. Однажды посаженное оно может без пересева давать высокие урожаи зеленой массы до 700 ц/га в течение более 15 лет с незначительными затратами на выращивание. В субстанции, полученной из листьев горца сахалинского, наряду с флавоноловыми веществами присутствуют вещества, относящиеся к классу флавонов и производных антрацена, с выраженным антиоксидантным и адаптогенным действием. Пример. 1 кг воздушно-сухих листьев горца сахалинского экстрагируют 72-90 -ным этиловым спиртом при температуре 15-20 С в течение трех суток (1 слив в сутки). Соотношение сырья к экстрагенту 15 соответственно. Объединенные элюаты концентрируют в вакууме при температуре 50-60 С до водного остатка, который затем помещают в колонку, наполненную полиамидным адсорбентом (250 г), размером 1050 см. Элюирование целевого продукта проводят 80 -ным этиловым спиртом, этанольные экстракты объединяют, центрифугируют при 60 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость отделяют и испаряют в испарителе при 50-60 С. Выход - 3,8-4,0 . Этанол и полиамид могут быть использованы многократно с небольшими потерями. Суммарный комплекс БАВ листьев горца сахалинского - аморфный порошок грязнозеленого цвета, хорошо растворим в этиловом спирту любого разбавления. Фитохимическими методами в суммарном препарате установлены, т.е. идентифицированы, основные компоненты, преобладающие в количественном отношении, а именно в группе флавонолов идентифицирован кверцетин, авикулярин, кверцитрин, гиперин, в группе флавонов - лютеолин-7-глюкозид и три виценина, производные апигенина, в группе антрагликозидов - фисцион и эмодин. Проведено комплексное доклиническое изучение выделенного комплекса БАВ и показано, что субстанция флавоноидов не проявляет первичной токсичности при ее пероральном введении беспородным мышам в 5-кратной терапевтической дозе. 50 субстанции БАВ составляет 6,06 г/кг массы тела. Пероральное введение нарастающих дозировок субстанции (от 4,5 до 9,0 г/кг массы) не вызывает гибели крыс линии Вистар и увеличение весовых коэффициентов основных органов обеспечения (табл. 1). Исследование острой токсичности БАВ горца сахалинского показало, что пероральное введение нарастающих дозировок препарата практически не сказывается на показателях красной и белой крови крыс Вистар (табл. 2). Изученный комплекс не нарушает функциональную белок-синтезирующую активность печени, не провоцирует чрезмерную активацию процессов эндогенного протеолиза,не вызывает дисбаланса в системе протеиназы - ингибиторы протеиназ и функциональную недостаточность экзопептидаз, не оказывает токсического повреждения почечной паренхимы, не нарушает функции почек по экскреции мочевины и креатинина (табл. 3). При изучении содержания продуктов перекисного окисления липидов в плазме крови крыс в диапазоне доз от 4,5 до 9,0 г/кг массы животного выявлена выраженная интенсификация процессов ПОЛ, обусловленная дозами (в несколько тысяч раз превышающими 2 11494 1 2008.12.30 терапевтическую) и проявлявшаяся в накоплении как промежуточных, так и конечного метаболита ПОЛ, дозовой зависимости при этом не установлено (табл. 4). При изучении хронической токсичности установлено, что пероральное введение БАВ горца сахалинского и препарата аналога рутина в течение 4-х месяцев не вызывало изменений красной крови экспериментальных животных. При введении исследуемого препарата в течение 1-2 месяцев повышался коагуляционный потенциал крови, что однако компенсировалось усилением плазминовой активности. При более длительном введении (3-4 месяца) комплекс БАВ оказывал гипокоагуляционное действие. При исследовании влияния препарата в отдаленном периоде отмечалась повышенная активность антикоагулянтов через 1 месяц и полное отсутствие какого-либо влияния спустя 3 месяца после окончания введения. В результате изучения специфических видов токсичности и специфической активности на модели истощающей физической нагрузки (плавание) БАВ горца сахалинского были сделаны следующие выводы. Интрагастрально вводимая животным субстанция горца сахалинского в пятикратной суточной терапевтической дозе не вызывала патоморфологических изменений в основных органах жизнеобеспечения организма и по своему действию ничем не отличалась от препарата рутина. У субстанции из горца сахалинского не выявлены тератогенные и эмбриотоксические эффекты. Исследование влияния субстанции БАВ фенольной природы на процессы ПОЛ при моделировании длительной утомляемости свидетельствует о том, что они оказывают антиоксидантное и адаптогенное действие при длительной нагрузке. Изучение состояния показателей свертывающей системы крови крыс при моделировании острой утомляемости с предварительным введением флавоноидов горца сахалинского показало их корригирующее влияние на адаптогенно-защитные механизмы, регулирующие свертывающую систему крови организма, находящегося в экстремальных условиях,поскольку изученный комплекс БАВ обладает рядом полезных биологических свойств,таких как антиоксидантное и адаптогенное в отношении отдельных молекулярнофизиологических механизмов поддержания гомеостаза. Установлено, что у исследуемого комплекса отсутствует выраженное негативное действие на основные структурно-метаболические системы организма экспериментальных животных. Таким образом, достигаемым техническим результатом заявляемого способа является возможность расширить сырьевую базу, являющуюся источником для создания группы лечебно-профилактических средств, улучшающих процессы адаптации и нормализации нарушенных функций организма, что крайне важно для развития отечественной фармакологической промышленности и уменьшения зависимости отечественной медицины от импорта аналогичных лекарственных средств. Таблица 1 Влияние различных дозировок субстанции флавоноидов на весовые коэффициенты основных внутренних органов крыс Серия Печень Сердце Легкое Селезенка Почки эксперимента Контроль 2,880,440 0,380,023 0,660,034 0,410,027 0,0610,019 4,5 г/кг 3,390,151 0,370,042 0,660,058 0,460,020 0,610,025 6,0 г/кг 3,140,113 0,380,011 0,710,063 0,460,052 0,610,014 7,5 г/кг 3,520,156 0,350,019 0,670,096 0,0410,032 0,610,029 9,0 г/кг 3,300,120 0,410,025 0,730,067 0,440,056 0,700,067 Примечание- достоверность различий по отношению к контролю при уровне значимости Р 0,05. 3 11494 1 2008.12.30 Таблица 2 Изменение цитогематометрических показателей периферической крови крыс при введении нарастающих дозировок субстанции флавоноидов Содержание Количество Количество Показатель Количество Условия гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, гематокрита, тромбоцитов,эксперимента г/л 1012/л 109/л 109/л Контроль 136,71,31 6,80,05 10,30,83 39,60,81 74745,81 4,5 г/кг 141,02,19 6,50,20 12,90,36 39,71,85 70834,68 6,0 г/кг 1382,20 6,80,27 16,51,31 41,82,94 70849,62 7,5 г/кг 141,54,13 7,00,24 12,81,17 42,13,53 64566,66 9,0 г/кг 130,71,76 6,70,29 12,50,91 39,41,50 90939,28 Примечание- уровень значимости различий при Р 0,05. Таблица 3 Влияние нарастающих дозировок субстанции флавоноидов на содержание белка и уровень метаболитов протеинового обмена в плазме крови крыс Условия Общий белок,Альбумин, г/л эксперимента г/л Контроль 57,82,78 25,81,03 4,5 г/кг 54,01,84 24,90,67 6,0 г/кг 63,01,85 22,31,14 7,5 г/кг 60,31,22 24,40,12 9,0 г/кг 56,72,27 21,91,47 Таблица 4 Содержание продуктов ПОЛ в плазме крови крыс при исследовании острой токсичности суммарных комплексов флавоноидов горца сахалинского в различных дозировках Условия эксперимента Контроль 4,5 г/кг 6,0 г/кг 7,5 г/кг 9,0 г/кг Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4