Способ получения липосомальной формы рифампицина

61 31/04, 31/06,31/08 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ РИФАМПИЦИНА(71) Заявитель Государственное научное учреждение ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ(72) Авторы Матус Виль Константинович Царенков Валерий Минович Гуревич Геннадий Львович Мартынова Мария Алексеевна Никольская Валентина Петровна Конев Сергей Васильевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ(57) 1. Способ получения липосомальной формы рифампицина путем формирования сухой липидной пленки из смеси липосомообразующих компонентов и рифампицина с последующим ее диспергированием в натрий-фосфатном буфере до получения липосом с включенным рифампицином, отличающийся тем, что в смесь липосомообразующих компонентов вводят в качестве заряд-формирующего компонента стеариновую кислоту при мольном соотношении фосфатидилхолинхолестеринстеариновая кислота равном 10,00,50,2, причем количество суммарных липидов составляет 20,0-75,0 мг на 1 мл буфера, рифампицин вносят из расчета 3,75 мг на 1 мл буфера, дополнительно в качестве антиоксиданта в смесь вводят -токоферол из расчета 0,02-0,04 мг на 1 мг суммарных липидов, к полученной сухой пленке добавляют 0,1 М натрий-фосфатный буфер, содержащий 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, полученную смесь прогревают, после чего инкапсулируют рифампицин методом высокоскоростного механического диспергирования в течение 10-15 минут до получения основной фракции мультиламелярных липосом с размером до 3,5 мкм, полученную суспензию липосомального рифампицина стабилизируют, причем инкапсулирование и стабилизацию проводят в атмосфере инертного газа. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что количество суммарных липидов составляет 50,0 мг на 1 мл буфера. 3. Способ по п. 1 или п. 2, отличающийся тем, что -токоферол вводят из расчета 0,02-0,04 мг на 1 мг суммарных липидов. 4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что смесь прогревают при 60 С в течение 5 минут, полученную суспензию липосом стабилизируют при 40 С в течение 1 часа, а в качестве инертного газа используют азот. 5614 1 Ахрем А.А. и др. Весц АН БССР, сер. хм. н. - 1991. -5. - С. 58-61... .. - 1996. -1. - . 221-222.2122855 1, 1998. Гуревич Г.Л. и др. Антибиотики и химиотерапия. - 1992. - Т. 37. -7. - С. 25. Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения липосомальной формы антибиотиков. Известен способ инкапсулирования рифампицина, предусматривающий получение сухой липидной пленки, состоящей из фосфатидилхолина (ФХ), холестерина (ХЛ) и кардиолипина (КЛ) в мольном соотношении 721 с последующим ее эмульгированием и диспергированием ультразвуком в буферном растворе рифампицина 1. Недостатками данного способа являются низкая эффективность инкапсулирования антибиотика, недостаточная стабильность лекарственной формы, а также сопутствующий аллергенный эффект препарата, обусловленный введением в липосомообразующую смесь кардиолипина в качестве компонента, формирующего заряд на поверхности липосом. Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ получения липосомального рифампицина, основанный на эмульгировании в фосфатном буфере сухой липидной пленки, состоящей из ФХ, ХЛ и децитилфосфата (ДФ) в мольном соотношении 712, содержащей рифампицин, с последующей ультразвуковой обработкой полученной эмульсии 2 (прототип). Однако и данный способ имеет ряд недостатков. Это низкая эффективность включения в липосомы антибиотика, недостаточная стабильность препарата при хранении и токсичность препарата за счет децитилфосфата и модифицирующего действия ультразвука на липиды. Задача изобретения - повышение эффективности инкапсулирования антибиотика,улучшение стабильности препарата при хранении, а также повышение качества лекарственной формы. Указанная задача решается тем, что оптимизируют состав липосомообразующей смеси и используют иной способ формирования липосом. Вместо аллергенного кардиолипина или токсичного децитилфосфата в качестве компонентов, формирующих на поверхности липосом заряд, используют стеариновую кислоту (СтК) и дополнительно вносят в липосомообразующую смесь антиоксидант токоферол. В эту же смесь исходно вносят и рифампицин. Поверхностный заряд препятствует агрегации липосом, а антиоксидант удерживает процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) липосом на низком уровне. Введение в липосомообразующую смесь антиоксиданта и проведение всех этапов инкапсулирования рифампицина в атмосфере инертного газа (азот) обеспечивают получение стабильной и нетоксичной лекарственной формы. Способ осуществляют следующим образом. Компоненты липосомообразующей смеси - яичный фосфатидилхолин (ЯФХ), холестерин (ХЛ), стеариновую кислоту (СтК) в мольном соотношении 100,50,2 вместе с -токоферолом (0,02-0,04 мг на 1,0 мг суммарных липидов) и рифампицином растворяют в хлороформе (из расчета 500-750 мг суммарных липидов и 35-40 мг рифампицина на 10 мл хлороформа) и упаривают под вакуумом в роторном испарителе при температуре 3540 С до образования сухой пленки. К полученной пленке добавляют 10 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера, содержащего 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (рН 7,4),смесь прогревают при 60 С на водяной бане 5 мин. Затем на высокоскоростном механическом миксере смесь диспергируют в течение 10-15 мин до получения основной фракции мультиламеллярных (МЛЛ) липосом размером до 3,5 мкм. Полученную суспензию липосомального рифампицина инкубируют в течение 1 часа при 40 С для стабилизации структуры липосомального конверта, охлаждают до комнатной температуры, расфасовывают в ампулы и лиофилизируют. Все операции проводят в атмосфере азота. Существенные отличия заявляемого способа от прототипа заключаются в следующем 2 5614 1 Во-первых, для придания липосомам отрицательного заряда в состав липосомальной мембраны вводят стеариновую кислоту вместо используемого в прототипе токсичного децитилфосфата. Она не токсична и полностью биодеградируема, поскольку продукты ее распада легко включаются в обменные процессы клеток. Установлено, что отрицательно заряженные липосомы более эффективно взаимодействуют с клеточными структурами легких, чем нейтральные 3, 4, а поверхностный заряд препятствует их агрегации. Во-вторых, в предлагаемом способе используют иное мольное соотношение липосомообразующих компонентов ЯФХХЛСтК, равное 100,50,2, тогда как в прототипе соотношение ФХХЛДФ равно 712. В заявляемом способе заметно увеличена доля ЯФХ, снижено содержание ХЛ и вместо ДФ используется СтК. Поскольку ЯФХ сам является биоантиоксидантом и иммуностимулятором, его можно рассматривать в качестве самостоятельного противовоспалительного средства 5, 6. Увеличение доли ЯФХ и уменьшение ХЛ, обладающего атерогенным действием, обеспечивает существенное повышение качества липосомальной формы рифампицина. В третьих, в заявляемом способе для ингибнрования ПОЛ в липосомообразующую смесь вводят 0,02-0,04 мг токоферола на 1 мг суммарных липидов, а ультразвуковую обработку заменяют высокоскоростным механическим диспергированием и все процедуры инкапсулирования антибиотика выполняют в атмосфере инертного газа (азота). Использование указанных приемов обеспечивает повышение стабильности новой лекарственной формы при хранении. Совокупность указанных признаков используют впервые, что обеспечивает положительные эффекты предлагаемого изобретения увеличивает эффективность инкапсулирования антибиотика, повышает стабильность липосомального рифампицина, уменьшает токсичность и, в целом, повышает качество лекарственной формы. Результаты патентных исследований позволяют считать совокупность существенных признаков заявляемого изобретения новой. С целью выяснения достоинств предлагаемого способа получения липосомальной формы рифампицина результаты испытания способа (в границах значений описанных в формуле заявки) сопоставлены с аналогичными данными способа прототипа. Сопоставляют следующие параметры эффективность инкапсулирования рифампицина, стабильность препарата, то есть длительность удержания антибиотика липосомами в процессе хранения и содержание в липосомах продуктов ПОЛ, а также размер и состав (удельное содержание типовых групп липосом) в полученных партиях. Учитывают три типовых группы размеров липосом мелкие (от 20 до 3500 нм) средние (от 3500 до 5000 нм) и крупные (более 5000 нм). Для определения количества рифампицина, инкапсулированного в липосомы, небольшое количество препарата наносят на колонку с сефадексом -50 и определяют концентрацию антибиотика спектрофотометрически (в двухволновом режиме 475/520) в составе липосом и свободного, разделяя его путем гель-фильтрации (или, в другом варианте, центрифугированием). Стабильность липосомального рифампицина оценивают по утечке антибиотика из липосом. Для этого хранящуюся в ампулах суспензию липосомального рифампицина через определенные сроки хранения пропускают через колонку с сефадексом -50 и по результатам спектрофотометрии рассчитывают процент связанного с липосомами антибиотика по отношению к исходному уровню. Содержание в липосомах продуктов ПОЛ определяют спектрофотометрически при длине волны 532 нм тиобарбитуровым методом. Сущность предлагаемого способа и граничные значения, указанные в формуле заявки,иллюстрируются следующими примерами. Пример 1. При постоянном мольном соотношении компонентов липосомообразующей смеси ЯФХХЛСтК - 100,50,2, заявленном в формуле, исследуют зависимость включения рифампицина в липосомы от суммарной концентрации липидов. Готовят четыре варианта 3 5614 1липосом с различной концентрацией суммарных липидов а) 20 ) 50 с) 75 ) 100 мг на 1,0 мл натрий-фосфатного буфера токоферол вносят из расчета 0,02 мг/мг суммарных липидов. Во все варианты добавляют одинаковое количество рифампицина - 37,5 мг на 10 мл натрий-фосфатного буфера. Указанные компоненты растворяют в хлороформе и упаривают на роторном испарителе при температуре 35-40 С до образования сухой пленки. К полученной пленке добавляют 10 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера, содержащего 0,1 мМ ЭДТА ( 7,4). Полученную смесь нагревают до 60 С в течение 5 минут и путем механического диспергирования на высокоскоростном миксере в течение 10-15 мин получают суспензию мультиламеллярных (МЛЛ) липосом с включенным рифампицином. Суспензию липосомального рифампицина инкубируют в течение 1 часа при 40 С для стабилизации структуры липосомального конверта. Невключившийся в липосомы рифампицин отделяют путем гель-фильтрации на колонках с сефадексом -50. Эффективность инкапсулирования рифампицина, рассчитанная по результатам спектрофотометрии липосомальных препаратов до и после гель-фильтрации, составляет в ряду вариантов а) 38,2 ) 49,1 с) 53,8 ) 47,8 , соответственно, от исходно взятого антибиотика. Суспензии полученных липосомальных препаратов лиофилизируют, запаивают в ампулы в атмосфере азота и используют, спустя различные сроки хранения, для оценки стабильности препарата (по удержанию антибиотика), физических параметров липосом (с помощью световой и электронной микроскопии) и активности процессов перекисного окисления липидов (по накоплению малонового диальдегида - МДА). Анализ результатов данного примера свидетельствует о том, что по мере увеличения концентрации липидов до 75 мг на 1 мл натрий-фосфатного буфера включение антибиотика в липосомы возрастает и составляет, соответственно, 14,32 18,41 и 20,20 мг рифампицина на 10 мл суспензии липосом. При увеличении концентрации суммарных липидов до 100 мг/мл натрий-фосфатного буфера включение рифампицина снижается до 17,93 мг на 10 мл суспензии. В прототипе включение составляет 3,37 мг рифампицина на 10 мл суспензии липосом. Следовательно, заявляемый способ позволяет увеличить эффективность включения антибиотика в 5,5-6,0 раз при использовании суммарной концентрации липидов 50 и 75 мг/мл натрий-фосфатного буфера. Оценка утечки антибиотика из липосом при хранении липосомального рифампицина в течение 6-ти месяцев показывает, что она составляет по вариантам от 8 до 11 . Содержание малонового диальдегида к концу периода хранения увеличивается по вариантам на 7-9 . Размер и состав (удельное содержание типовых по размеру групп липосом) в процессе хранения препарата заметно не изменяется. Пример 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1, используя заявленное в формуле соотношение ЯФХХЛСтК - 100,50,2 и токоферол в конечной концентрации 0,02 мг/мг суммарных липидов. При концентрации суммарных липидов 50 мг/мл натрий-фосфатного буфера в липосомообразующую смесь вносят различные количества рифампицина. Готовят три варианта липосом а) 37,50 ) 18,75 с)56,25 мг на 10 мл натрий-фосфатного буфера. В указанных вариантах включение антибиотика, соответственно, составляет 48,315,4 и 28,9 от исходно внесенного в натрий-фосфатного буфера. Размер липосом по данным микроскопии, как и в примере 1, практически не изменяется. Содержание продуктов ПОЛ в процессе хранения увеличивается на 5-8 по отношению к исходному уровню. Данные, полученные в примере 2, свидетельствуют о том, что включение рифампицина в липосомы имеет выраженную зависимость от содержания антибиотика в липосомообразующей смеси. Наиболее высокая эффективность его использования достигается при внесении 37,5 мг рифампицина на 10 мл натрий-фосфатного буфера. Уменьшение доли антибиотика в липосомообразующей смеси в два раза или увеличение в 1,5 раза приводит к заметному снижению эффективности инкапсулирования рифампицина (в). Хотя в 3-ем варианте включение рифампицина оказывается достаточно высоким, однако при этом неоправданно увеличивается расход липосомообразующих компонентов. 4 5614 1 Пример 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но в состав липосомообразующей смеси вносят различные количества токоферола. Готовят пять вариантов липосомообразующей смеси, различающихся между собой по содержанию антиоксиданта 1) 0,01 2) 0,02 3) 0,03 4) 0,04 и 5) 0,05 мг антиоксиданта на 1 мг суммарных липидов. В вариантах с 1-го по 5-ый включение рифампицина в липосомы, соответственно, составляет 22,5 23,1 32,2 34,8 и 13,9 от исходно внесенного в липосомообразующую смесь. Из примера 3 видно, что более высокая эффективность включенияантибиотика достигается при введении в реакционную смесь 0,02 - 0,04 мг токоферола на 1 мг суммарных липидов. Уменьшение относительного содержания антиоксиданта до 0,01 мг/мг липидов, т.е. ниже значения, указанного в формуле изобретения, равно как и увеличение его содержания до 0,05 мг/мг липидов, т.е. выше граничного значения, приводит к снижению эффективности инкапсулирования рифампицина. Исследование стабильности липосомального рифампицина по утечке антибиотика из липосом после различных сроков хранения показывает,что все варианты липосом за исключением 5-го, содержащего максимальную концентрацию антиоксиданта - 0,05 мг/мг липидов, имеют высокую стабильность по удержанию рифампицина. За 6 месяцев хранения его выход составляет 6-9 от исходного уровня. Содержание МДА за 6 месяцев хранения различных вариантов препарата изменяется неодинаково. При внесении 0,03, 0,04 и 0,05 мг токоферола на 1 мг липосомообразующей смеси содержание МДА увеличивается на 4-7 по отношению к начальному уровню. В 1 варианте, в который вносят 0, 01 мг токоферола на 1 мг липида, т.е. ниже граничного значения, указанного в формуле заявки, содержание МДА увеличивается на 14-15 . Результаты примера 3 показывают, что для эффективного подавления процессов ПОЛ и высокой эффективности инкапсулирования антибиотика в липосомообразующую смесь следует вносить антиоксидант из расчета 0,02-0,04 мг на 1 мг суммарных липидов. Таким образом, оптимизация состава липосомообразующей смеси и формирование липосом с помощью механического диспергирования позволяет а) в 5,5-6,0 раз увеличить эффективность инкапсулирования рифампицина б) исключить аллергенное или токсичное действие вводимых зарядоформирующих компонентов липосом - кардиолипина (аналог) или децитилфосфата (прототип) в) повысить стабильность липосомальной формы рифампицина введением в липосомообразующую смесь 0,02-0,04 мг токоферола на 1 мг суммарных липидов. В комплексе указанные характеристики заявляемого способа получения липосомального рифампицина приводят к повышению качества новой лекарственной формы. Источники информации 1... Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.