Способ получения липосомальной формы рифампицина

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ РИФАМПИЦИНА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Бушмакина Ирина Михайловна Мартынова Мария Алексеевна Скоринко Елена Васильевна Конев Сергей Васильевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ получения липосомальной формы рифампицина, включающий растворение в хлороформе яичного фосфатидилхолина, холестерина, стеариновой кислоты, взятых в молярном соотношении, соответственно, 100,50,2, рифампицина, взятого из расчета 0,075 мг на 1 мг указанных выше липидов, и токоферола, взятого из расчета 0,02 мг на 1 мг указанных выше липидов, упаривание раствора на роторном испарителе при температуре 352,5 С до получения сухой пленки, внесение 0,1 М -фосфатного буфера рН 7,4, содержащего 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, получение суспензии липосом с инкапсулированным в них рифампицином путем механического диспергирования смеси при температуре 60 С в течение 15 минут в атмосфере инертного газа и стабилизацию полученных липосом путем инкубирования суспензии при 40 С в течение 1 часа в атмосфере инертного газа, отличающийся тем, что вносят 1 мл буфера на 150-200 мг указанных выше липидов. Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к разработке новых лекарственных средств на основе липосом. Известен способ получения липосомального рифампицина, основанный на эмульгировании в фосфатном буфере сухой липидной пленки, состоящей из фосфатидилхолина(ФХ), холестерина (ХЛ) и децитилфосфата (ДФ) в мольном соотношении 712, содержащей рифампицин, с последующей ультразвуковой обработкой полученной эмульсии 1. Однако данный способ имеет недостаток, выраженный в токсичности препарата за счет децитилфосфата и модифицирующего действия ультразвука на липиды. Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ получения липосомального рифампицина, основанный на высокоскоростном ме 9902 1 2007.10.30 ханическом диспергировании в 0,1 М -фосфатном буфере сухой липидной пленки, состоящей из яичного фосфатидилхолина, холестерина и стеариновой кислоты в молярном соотношении 100,50,2 при концентрации суммарной липидов от 20 до 75 мг на 1 мл суспензии, содержащей рифампицин и токоферол в качестве антиоксиданта 2 (прототип). При этом степень инкапсулирования рифампицина в липосомы достигает 50 от внесенного в инкубационную смесь. Стабильность препарата в процессе хранения оценивалась по содержанию в липосомах продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Недостатками данного способа являются невысокий уровень включения антибиотика в липосомы (половина от внесенного в инкубационную смесь), а также недостаточная стабильность препарата при хранении. Задачей изобретения является расширение ассортимента лекарственных средств, используемых при лечении туберкулеза, путем создания липосомальной формы рифампицина с высокой степенью включения антибиотика в состав липосом и увеличение срока хранения лекарственной формы за счет низкого уровня окислительной деструкции рифампицина. Поставленная задача достигается тем, что в способе получения липосомального рифампицина, включающего растворение в хлороформе яичного фосфатидилхолина, холестерина, стеариновой кислоты, взятых в молярном соотношении соответственно 100,50,2,рифампицина, взятого из расчета 0,075 мг на 1 мг указанных выше липидов, и -токоферола, взятого из расчета 0,02 мг на 1 мг указанных выше, упаривание раствора на роторном испарителе при температуре 352,5 С до получения сухой пленки, внесение 0,1 М -фосфатного буфера рН 7,4, содержащего 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, получение суспензии липосом с инкапсулированным в них рифампицином путем механического диспергирования смеси при температуре 60 С в течение 15 минут в атмосфере инертного газа, инкапсулирования рифампицина в атмосфере инертного газа и стабилизацию полученных липосом путем инкубирования суспензии при 40 С в течение 1 часа в атмосфере инертного газа, на 1 мл буфера вносят 150-200 мг указанных выше липидов. При этом липосомальная мембрана переходит в новое физико-химическое состояние. Способ осуществляют следующим образом. Основными компонентами липосомообразующей смеси служат яичный фосфатидилхолин, холестерин и стеариновая кислота в молярном соотношении 100,50,2. Суммарную концентрацию липидов повышают до 150-200 мг на 1 мл буфера. Для предотвращения перекисного окисления липидов добавляют антиоксидант токоферол из расчета 0,02 мг на 1 мг суммарных липидов. Рифампицин вносят в основной (гидрофобной) форме. Все компоненты липосомообразующей смеси растворяют в хлороформе и упаривают на роторном испарителе при температуре 352,5 С до получения сухой пленки. Далее в колбу вносят 0,1 М -фосфатный буфер (рН 7,4), содержащий 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), и заполняют ее азотом. Липосомы получают путем механического диспергирования при температуре 60 С, что выше температуры фазового перехода используемых липидов, на высокоскоростном миксере в течение 15 мин, а затем полученную суспензию инкубируют при 40 С в течение часа для стабилизации липосомального контейнера. Свежеприготовленную субстанцию липосомального рифампицина разливают в ампулы, сублимационно высушивают (лиофилизируют) по специальной программе, после чего их запаивают в атмосфере азота. Хранят ампулы при температуре(2-4) С без доступа света. Уровень инкапсулирования рифампицина в липосомы оценивают методом центрифугирования, для чего препарат липосомального рифампицина предварительно регидратируют следующим образом в ампулы добавляют соответствующий объем дистиллированной воды, оставляют для набухания в течение 5 мин, после чего встряхивают до достижения гомогенного состояния суспензии. Далее полученную суспензию разводят 0,1 М -фос 2 9902 1 2007.10.30 фатным буфером, содержащим 0,1 мМ ЭДТА (рН 7,4), до концентрации суммарных липидов 10 мг на 1 мл суспензии. Центрифугируют при 15 000 об./мин в течение 5 минут. Осадок содержит рифампицин в составе липосом, а надосадочная жидкость - свободный,не включившийся в состав липосом, рифампицин. Соответствующую концентрацию рифампицина определяют спектрофотометрическим методом при 475 нм. Уровень инкорпорирования рифампицина в липосомы достигает 85-95 от внесенного в инкубационную смесь. Следует подчеркнуть, что рифампицин-основание в силу своих гидрофобных свойств встраивается в липосомальные мембраны. Нами установлено по результатам изучения поляризации флюоресценции липофильного зонда 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриена, встроенного в липосомальный рифампицин, что по мере повышения концентрации суммарных липидов растет и плотность упаковки компонентов липосомальной мембраны. Другими словами, субстанция липосомального рифампицина при высокой концентрации суммарных липидов переходит в новое физико-химическое состояние, которое приводит к существенному росту эффективности встраивания антибиотика в липосомы, и, кроме того,более плотная упаковка компонентов липосомальной мембраны стабилизирует лекарственную форму при хранении. Отличительным признаком предлагаемого изобретения является повышение концентрации суммарных липидов при определенном соотношении рифампицина, антиоксиданта и липидов, что приводит к изменению физико-химического состояния мембранных структур липосомальной формы лекарственной субстанции, сопровождающемуся значительным увеличением степени встраивания антибиотика в липосомы и уменьшением окисления активного вещества препарата в процессе хранения. Результаты патентных исследований позволяют считать отличительный признак заявляемого изобретения новым. Сущность предлагаемого способа и граничные значения, указанные в формуле заявки,иллюстрируются следующими конкретными примерами. Пример 1 Исследуют влияние концентрации суммарных липидов на эффективность встраивания антибиотика в липосомы. Все компоненты липосомообразующей смеси (яичный фосфатидилхолин, холестерин и стеариновую кислоту в молярном соотношении 100,50,2, токоферол из расчета 0,02 мг на 1 мг суммарных липидов, рифампицин в концентрации 0,075 мг на 1 мг суммарных липидов) растворяют в хлороформе и упаривают на роторном испарителе в круглодонной колбе при температуре 352,5 С до получения сухой пленки. Далее вносят 0,1 М -фосфатный буфер, содержащий 0,1 мМ ЭДТА (рН 7,4) и заполняют колбу азотом. Липосомы получают путем механического диспергирования при температуре 60 на высокоскоростном миксере в течение 15 мин, после чего полученную суспензию инкубируют при 40 С в течение часа для стабилизации липосомальной мембраны. Свежеприготовленную субстанцию липосомального рифампицина разливают в ампулы,сублимационно высушивают, после чего их запаивают в атмосфере азота. Хранят ампулы при температуре(2-4) С без доступа света. Непосредственно перед использованием лиофилизированную субстанцию регидратируют. Исследуют концентрационный ряд суммарных липидов 50, 100, 150, 200, 300, 400 мг на 1 мл буфера. Оказалось, что максимальная величина инкапсулирования (85-95 от внесенного в инкубационную смесь) достигалась при использовании суммарной концентрации липидов 150-200 мг на 1 мл буфера (табл. 1). При концентрации суммарных липидов 300 и 400 мг на 1 мл буфера формируется слишком густая суспензия липосом, и, как оценено микроскопией, липосомы находятся в агрегированном состоянии. 9902 1 2007.10.30 Таблица 1 Влияние концентрации липидов в липосомообразующей смеси на эффективность включения антибиотика Концентрация Концентрация суммарных липидов, мг рифампицина, мг на 1 мг на 1 мл буфера суммарных липидов 50 0,075 100 0,075 150 0,075 200 0,075 300 0,075 400 0,075 Пример 2 Исследуют стабильность липосомального рифампицина при хранении по показателю Сумма примесей. Способ получения липосомального рифампицина осуществляют, как описано в примере 1. Концентрация суммарных липидов 200 мг на 1 мл буфера. Концентрация рифампицина 0,075 мг на 1 мг суммарных липидов. Результаты измерений представлены в табл. 2. Учитывая высокую чувствительность рифампицина к влаге воздуха, кислороду, температуре, свету, важно добиться низких уровней продуктов его окисления. В соответствии с Фармакопейной статьей 42 Б-69-97 проводят оценку параметра Сумма примесей, который не должен превышать 4 . Таблица 2 Стабильность липосомального рифампицина при хранении по показателю Сумма примесей Сумма примесей рифам- Свежепригопицина,товленные 0,37 Определение продуктов окислительной деградации липосомального рифампицина в процессе хранения выполняют согласно методике ФС 42 Б-69-97. Для разделения основного активного вещества антибиотика и содержащихся примесей проводят тонкослойную хроматографию хлороформных растворов липосомального рифампицина на двух пластинахв системе растворителей хлороформметанолвода в соотношении 80202(по объему). Затем с одной пластины снимают силикагель от линии старта до линии фронта (исключая зону основного вещества), прибавляют раствор А, состоящий из смеси 0,1 М-фосфатный буферводаметанол в соотношении 1090150 (по объему). В течение 5 мин из пробы количественно экстрагируют определяемые вещества (раствор Б). Аналогично обрабатывают всю область силикагеля с другой пластины (включая зону основного вещества) и получают раствор В. Содержание суммы примесей родственных веществ в препарате в процентах вычисляют как соотношение оптических плотностей растворов Б/ при длине волны 475 нм,соответствующей максимуму поглощения антибиотика. Как видно из табл. 2, липосомы, содержащие рифампицин, внесенный в концентрации 0,075 мг на 1 мг суммарных липидов, на протяжении 16 месяцев хранения сохраняют стабильность (количество примесей варьирует от 1,4 до 2,4 ). 4 9902 1 2007.10.30 Были исследованы субстанции липосомального рифампицина с исходной повышенной концентрацией антибиотика до 0,15 и 0,2 мг на 1 мг суммарных липидов. Обнаружено,что такие субстанции липосомального рифампицина при хранении становятся нестабильными, о чем свидетельствует увеличение количества примесей до 5,1 и 5,7 соответственно в течение 16 месяцев. Таким образом, рифампицин, включившийся в состав липосомальных мембран, при высокой концентрации суммарных липидов (150-200 мг на 1 мл буфера) защищен от окисления и сохраняет стабильность при хранении в течение 16 месяцев. Источники информации 1..,.. // . 1989.. 33,4. . 429-433. 2. Матус В.К., Царенков В.М., Гуревич Г.Л., Мартынова М.А., Никольская В.П., Конев С.В. Патент РБ 5614 Способ получения липосомальной формы рифампицина, от 23.06.2003 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5