Способы определения концентрации люмирубина в смеси фотопродуктов Z,Z-билирубина IX? , связанного с сывороточным альбумином человека

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ЛЮМИРУБИНА В СМЕСИ ФОТОПРОДУКТОВ ,-БИЛИРУБИНА , СВЯЗАННОГО С СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ ЧЕЛОВЕКА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физики имени Б.И.Степанова Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Плавский Виталий Юльянович Мостовников Василий Андреевич Мостовникова Галина Ростиславовна Третьякова Антонина Ивановна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физики имени Б.И.Степанова Национальной академии наук Беларуси(57) 1. Способ определения абсолютной концентрации люмирубина в смеси фотопродуктов ,-билирубина , связанного с сывороточным альбумином человека, заключающийся в регистрации спектроскопических характеристик смеси, отличающийся тем, что регистрируют спектры флуоресценции, возбуждаемой последовательно излучением с 1) длиной волны(возб 54010 нм , индуцирующей флуоресценцию в диапазоне 560-800 нм 11370 1 2008.12.30 наиболее длинноволновой полосой флуоресценции среди фотопродуктов ,-билирубина 2), при этом абсолютную кон бранного фотопродукта общей интенсивностью 2 центрацию люмирубина Сх в смеси определяют из выражения(эт /эт ) ,2 где Сэт - концентрация эталонного раствора люмирубина- интенсивность флуоресценции в диапазоне 560-800 нм эталонного рас 560 1) твора люмирубина при длине волны возбуждения(возб 54010 нм 800- интенсивность флуоресценции выбранного фотопродукта в спек 635 1) тральном диапазоне 635-800 нм при возбуждении флуоресценции(возб 54010 нм , определяемая на основании измерения спектра флуоресценции при возбуждении 2)(возб 6205 нм с последующим нормированием указанного спектра до величины,обеспечивающей его совмещение в диапазоне 750-800 нм с указанным участком спектра 1) флуоресценции смеси при ее возбуждении при(возб 54010 нм . 2. Способ определения относительной концентрации люмирубина в смеси фотопродуктов ,-билирубина , связанного с сывороточным альбумином человека, заключающийся в регистрации спектроскопических характеристик смеси, отличающийся тем,что регистрируют спектры флуоресценции, возбуждаемой последовательно излучением с 1) длиной волны(возб 54010 нм , индуцирующей флуоресценцию в диапазоне 560-800 800 нм общей интенсивностью зуемого наиболее длинноволновой полосой флуоресценции среди фотопродуктов ,2) билирубина , и(возб 6205 нм , индуцирующей флуоресценцию в диапазоне 635800 800 нм выбранного фотопродукта общей интенсивностью 2, при этом относи 2 тельную концентрацию люмирубина Сотн в смеси определяют из выраженияотн ,2 где К - коэффициент пропорциональности- интенсивность флуоресценции выбранного фотопродукта в спек 635 1) тральном диапазоне 635-800 нм при возбуждении флуоресценции(возб 54010 нм ,определяемая на основании измерения спектра флуоресценции при возбуждении 2)(возб 6205 нм с последующим нормированием указанного спектра до величины,обеспечивающей его совмещение в диапазоне 750-800 нм с указанным участком спектра 1) флуоресценции смеси при ее возбуждении при(возб 54010 нм . 11370 1 2008.12.30 Изобретение относится к аналитической химии и фотохимии тетрапиррольных соединений, в частности к фотоизомеризации и фотоциклизации ,-билирубина , и может быть использовано для контроля уровня люмирубина (циклобилирубина), определяющего эффективность фототерапии гипербилирубинемии новорожденных детей, обусловленной избыточным накоплением в организме младенца ,-билибина . Известен способ определения концентрации люмирубина (другое название данного продукта - циклобилирубин) в смеси фотопродуктов билирубина, содержащей люмирубин, нативный ,-билирубинаи его геометрические изомеры, включая ,билирубин , Е,-билирубин , ,-билирубин , а также биливердин и др. 1. Способ заключается в разделении смеси на отдельные компоненты с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращением фазы. В качестве элюента используется смесь воды (7 ) и 0,1 М диоктиламинацетата в метаноле. Скорость протока жидкости составляет 1 мл/мин. Относительная концентрация каждой компоненты,включая люмирубин, определяется путем контроля оптической плотности в области максимума спектра поглощения фотоизомеров билирубина на длине волны 450 нм с последующим пересчетом с учетом коэффициента молярной экстинкции каждой компоненты. Недостатками известного способа являются использование в качестве элюента токсичного растворителя (метанола), а также необходимость периодической замены хроматографических колонок, со временем забивающихся анализируемым веществом. Еще один недостаток известного способа - длительность проведения анализа. Так, согласно 1 пик,соответствующий прохождению основного вещества (,-билирубина ) при хроматографическом разделении смеси фотопродуктов билирубина методом ВЭЖХ, наблюдается через 25 минут после старта. Наиболее близким по сущности к заявляемому способу определения концентрации люмирубина в смеси фотопродуктов , -билирубинаявляется способ, описание которого приведено в 2. Способ основан на измерении спектров поглощения в области 350-700 нм как интактного, то есть необлученного раствора ,-билирубина , находящегося в комплексе с сывороточным альбумином человека, так и указанного раствора после его облучения. Присутствие альбумина в растворе обусловлено, во-первых, крайне низкой растворимостью ,-билибин Х в водной среде, а во-вторых, тем фактом, что в крови билирубин находится в составе комплекса с альбумином и комплексообразование существенно влияет на закономерности фотоизомеризации и фотоциклизации ,билирубина Х. Необлученный водный раствор ,-билибин Х в присутствии альбумина характеризуется длинноволновым спектром поглощения с максимумом в области 460 нм. Согласно 2, при поглощении света ,-билирубином , связанного с альбумином, в спектре поглощения наблюдается снижение оптической плотности (А) в области 380-520 нм и прирост А в спектральных диапазонах 300-380 нм и 520-700 нм. Причинами снижения оптической плотности в области максимума спектра поглощения ,-билирубинаявляются более низкие значения молярного коэффициента экстинкции образующихся фотопродуктов (люмирубина, ,-билирубина , Е,-билирубина , Е,Е-билирубина, а также продуктов фотоокисления). Причем наиболее выраженные различия в коэффициентах поглощения наблюдаются между ,-билибинми люмирубином. По этой причине уменьшение оптической плотности на длине волны 460 нм (460) при воздействии оптического излучения обусловлено, прежде всего, образованием люмирубина(циклобилирубина) из ,-билирубина . Авторами 2 путем сопоставления концентрации люмирубина, измеренной методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, и измерений спектров поглощения показано, что процент снижения оптической плотности на длине волны 460 нм (460) при низких дозах воздействующего излучения прямо пропорционален концентрации образующегося люмирубина (циклобилирубина). 11370 1 2008.12.30 Таким образом, способ определения относительной концентрации люмирубина в смеси фотопродуктов билирубина, предложенный в 2, состоит в определении процента снижения оптической плотности на длине волны 460 нм (А 460) облученного раствора ,билирубина , связанного с сывороточным альбумином человека, в сравнении с оптической плотностью интактных, необлученных растворов. Недостатком известного способа является тот факт, что с его помощью можно определить лишь относительный уровень люмирубина (циклобилирубина) в смеси фотопродуктов. При этом способ, описание которого приведено в 2, не позволяет произвести оценку абсолютной концентрации люмирубина в молях или мг/мл в смеси фотопродуктов. Еще один существенный недостаток известного способа состоит в том, что линейная зависимость между концентрацией люмирубина и процентом снижения оптической плотности на длине волны 460 нм (А 460) облученного раствора ,-билирубина Х, связанного с сывороточным альбумином человека, наблюдается до тех пор, пока снижение А 460 не превышает 23 . При дальнейшем облучении раствора оптическая плотность на длине волны А 460 нм продолжает снижаться, однако концентрация люмирубина (циклобилирубина),как следует из данных хроматографических исследований 2, практически не меняется. То есть способ, предложенный в 2, позволяет оценить относительную концентрацию люмирубина лишь при низкой поглощенной дозе. При более высоких дозах воздействующего излучения в растворе становится значительным вклад продуктов фотоокисления билирубина, не поглощающих на длине волны 460 нм, но являющихся причиной дальнейшего снижения А 460, не связанного с образованием люмирубина. Вклад продуктов фотоокисления становится особенно выраженным при облучении кислородсодержащих растворов ,-билирубина Х, что резко увеличивает погрешность определения относительной концентрации люмирубина известным методом. То есть известный способ дает различные результаты в определении уровня люмирубина для образцов, облученных в кислородсодержащих и обескислороженных условиях, хотя, как следует из данных хроматографических анализов, концентрация образующегося люмирубина не зависит от концентрации кислорода в облучаемой смеси. Задачей предполагаемого изобретения является разработка способа контроля как абсолютной концентрации люмирубина, так и его относительной концентрации (то есть концентрации в одном растворе по отношению к концентрации в другом растворе) в смеси,содержащей наряду с люмирубином и ,-билибинм Х, связанным с сывороточным альбумином человека, другие фотопродукты ,-билирубина , включая ,-билирубин, Е,-билирубин , Е,Е-билирубин , а также продукты фотоокисления ,билирубинабез разделения смеси на отдельные компоненты. Поставленная задача решается следующим образом. В способе определения абсолютной концентрации люмирубина в смеси фотопродуктов ,-билирубина , связанного с сывороточным альбумином человека, заключающемся в регистрации спектроскопических характеристик смеси, регистрируют спектры флуоресценции, возбуждаемой 1) последовательно излучением с длиной волны (возб 54010 нм, индуцирующей флуоресценцию в диапазоне 560-800 нм общей интенсивностью фотопродукта смеси, характеризуемого наиболее длинноволновой полосой флуоресцен 2) ции среди фотопродуктов ,-билирубина , и (возб 6205 нм, индуцирующей флуоресценцию в диапазоне 635-800 нм выбранного фотопродукта общей интенсивностью 2, при этом абсолютную концентрацию люмирубина С в смеси опреде 635( эт /эт ) ,2 где Сэт - концентрация эталонного раствора люмирубина 800- интенсивность флуоресценции в диапазоне 560-800 нм эталонного раство 560 1) ра люмирубина при длине волны возбуждения (возб 54010 нм- интенсивность флуоресценции выбранного фотопродукта в спек 635 1) тральном диапазоне 635-800 нм при возбуждении флуоресценции (возб 54010 нм,определяемая на основании измерения спектра флуоресценции при возбуждении 2)(возб 6205 нм с последующим нормированием указанного спектра до величины,обеспечивающей его совмещение в диапазоне 750-800 нм с указанным участком спектра 1) флуоресценции смеси при ее возбуждении при (возб 54010 нм. Для определения относительной концентрации люмирубина в смеси фотопродуктов,- билирубина , связанного с сывороточным альбумином человека, заключающемся в регистрации спектроскопических характеристик смеси, регистрируют спектры флуорес 1) ценции, возбуждаемой последовательно излучением с длиной волны (возб 54010 нм,индуцирующей флуоресценцию в диапазоне 560-800 нм общей интенсивностью люмирубина и фотопродукта смеси, характеризуемого наиболее длинно 560 волновой полосой флуоресценции среди фотопродуктов ,-билирубина , и 2)(возб 6205 нм, индуцирующей флуоресценцию в диапазоне 635-800 нм выбранного фотопродукта общей интенсивностью 2, при этом относительную концентра 635 цию люмирубина Сотн в смеси определяют из выраженияотн ,2 где- коэффициент пропорциональности- интенсивность флуоресценции выбранного фотопродукта в спек 635 1) тральном диапазоне 635-800 нм при возбуждении флуоресценции (возб 54010 нм, определяемая на основании измерения спектра флуоресценции при возбуждении 2)(возб 6205 нм с последующим нормированием указанного спектра до величины,обеспечивающей его совмещение в диапазоне 750-800 нм с указанным участком спектра 1) флуоресценции смеси при ее возбуждении при (возб 54010 нм. Сущность способа определения концентрации люмирубина (циклобилирубина) поясняется чертежами, где на фиг. 1 показаны структурные формулы ,-билирубинаи люмирубина на фиг. 2 - спектры поглощения ,-билирубина , связанного с сывороточным альбумином человека, до облучения и при облучении кислородсодержащих растворов излучением гелий-кадмиевого и аргонового лазеров на фиг. 3 - спектры поглощения ,-билирубина , связанного с сывороточным альбумином человека до облучения и при облучении обескислороженных растворов излучением гелий-кадмиевого и 11370 1 2008.12.30 аргонового лазеров на фиг. 4 - спектры флуоресценции ,-билирубина , связанного с сывороточным альбумином человека, до облучения и спектры флуоресценции смеси фотопродуктов, образовавшихся в результате облучения кислородсодержащих растворов излучением гелий-кадмиевого и аргонового лазеров на фиг. 5 - спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции фотопродуктов, образующихся в результате облучения,-билирубина , связанного с сывороточным альбумином человека, излучением аргонового лазера на фиг. 6 - спектры флуоресценции смеси двух фотопродуктов, включая люмирубин, а также спектр флуоресценции люмирубина. Как следует из фиг. 1, молекулы люмирубина, как и молекулы ,-билирубинасостоят из двух хромофоров (хромофораи хромофора ), каждый из которых характеризуется собственным спектром поглощения и флуоресценции. При этом хромофорыявляются структурно идентичными для указанных соединений. Структура хромофорадля молекулы ,-билибинамолекулы люмирубина отличается, что является предпосылкой для разработки способа определения концентрации люмирубина в растворе, основанном на регистрации флуоресценции хромофора . Воздействие света на ,-билибин , связанный с альбумином, приводит к изменению спектров поглощения билирубина. Спектр поглощения раствора ,-билирубина(концентрация 2 мкМ), связанного с альбумином (концентрация 1 мкМ), до облучения показан на фиг. 2, кривая 1. Максимум спектра поглощения ,-билирубинав составе комплекса расположен при 460 нм. В результате воздействия на кислородсодержащие растворы в течение 30 мин излучением аргонового лазера с длиной волны 514,5 нм и плотностью мощности Р 10 мВт/см 2 наблюдается снижение оптической плотности в максимуме спектра поглощения ,-билирубина Х, что отражает кривая 2 на фиг. 3. Воздействие с той же интенсивностью излучением гелий-кадмиевого лазера с 441,6 нм также сопровождается снижением оптической плотности в максимуме спектра поглощения, что отражает кривая 3 на фиг. 2. На фиг. 3 показано изменение спектров поглощения растворов ,-билирубина Х(концентрация 2 мкМ), связанного с альбумином (концентрация 1 мкМ) при их облучении излучением тех же лазеров в обескислороженных условиях. При этом кривая 1 относится к необлученному раствору, кривая 2 - к раствору, облученному в течение 30 мин излучением аргонового лазера с длиной волны 514,5 нм и плотностью мощности Р 10 мВт/см 2, кривая 3 - к раствору, облученному в течение 30 мин излучением гелийкадмиевого лазера с длиной волны 441,6 нм и плотностью мощности Р 10 мВт/см 2. Как следует из сопоставления данных, представленных на фиг. 2 и фиг. 3, при облучении кислородсодержащих растворов наблюдается более выраженное подсаживание спектра поглощения, чем для обескислороженных растворов. Указанное влияние кислорода объясняется тем, что в аэробных условиях под действием излучения в билирубине, кроме процессов фотоизомеризации, протекают фотохимические реакции самосенсибилизированного окисления с образованием ряда бесцветных фотопродуктов. Увеличение их концентрации, а также концентрации фотоизомеров, характеризующихся коротковолновым расположением полосы поглощения, и является одной из причин прироста оптической плотности в ультрафиолетовой части спектра по мере увеличения дозы облучения. Следует отметить, что поскольку одна из полос поглощения люмирубина, обусловленная наличием в его структуре хромофора , расположена в области 455 нм, то, возбуждая флуоресценцию при указанной длине волны, можно было бы по интенсивности спектра флуоресценции люмирубина в смеси фотопродуктов определять концентрацию люмирубина, поскольку концентрация люмирубина прямо пропорциональна интенсивности его флуоресценции. На фиг. 4 представлены спектры флуоресценции при длине волны возбуждения возб 455 нм ,-билирубина , связанного с сывороточным альбумином человека, до облучения (кривая 1) и спектры флуоресценции смеси фотопродуктов, образо 6 11370 1 2008.12.30 вавшихся в результате облучения указанных кислородсодержащих растворов излучением гелий-кадмиевого (кривая 2) или аргонового (кривая 3) лазеров. Как следует из рисунка,при возбуждении флуоресценции в области поглощения хромофораспектры флуоресценции необлученного и облученных растворов отличаются очень незначительно. По этой причине указанная область спектра не может использоваться для селективного возбуждения люмирубина. Представленные на фиг. 5 спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции фотопродуктов, образующихся в результате облучения ,-билирубина Х, связанного с сывороточным альбумином человека, излучением аргонового лазера, показывают, что для возбуждения флуоресценции люмирубина может использоваться излучение с длиной волны, соответствующей возбуждению хромофора . Так, кривые 1 и 2 на фиг. 5 представляют собой спектры флуоресценции, возбуждаемой, соответственно, при длине волны 1) 1) 2)(возб 6205 нм и (возб 54010 нм. Как следует из фигуры, при (возб 54010 нм спектр флуоресценции фотопродуктов характеризуется двумя максимумами, расположенными при 650 и 706 нм (кривая 2). При смещении возбуждения в более длинноволно 2) вую область (возб 6205 нм в спектре флуоресценции регистрируется одна полоса с максимумом при 706 нм (кривая 1). В спектре возбуждения флуоресценции при рег 680 нм (кривая 4) максимумы расположены в области 337 нм, 455 нм и 592 нм, а при рег 740 нм (кривая 3) - 377 нм и 620 нм. Причем фотопродукт, характеризующийся максимумами поглощения при 337 нм, 455 нм и 592 нм, а люминесценцией при макс 650 нм,представляет собой люмирубин. За поглощение света в области макс 455 нм ответственен хромофорлюмирубина, а в области макс 592 нм и макс 337 нм поглощение обусловлено хромофором , содержащим два пиррольных фрагмента и семичленное кольцо. Указанный хромофор относится к небензоидным ароматическим соединениям (производным азаазулена). Фотопродукт, характеризующийся поглощением в области макс 377 нм и макс 620 нм и люминесценцией при макс 706 нм, образуется из люмирубина в результате отрыва водорода от метиленовой группы, соединяющей оба хромофора. Примечательно, что в длинноволновой части спектра поглощает еще один фотопродукт билирубина - биливердин. Его спектр поглощения в комплексе с альбумином характеризуется максимумами в области макс 380 нм и макс 670 нм, однако в облученной смеси он обнаруживается в следовых количествах и практически не флуоресцирует. Таким образом, люмирубин, ответственный за снижение уровня билирубина в организме новорожденных детей при проведении фототерапии гипербилирубинемии, наряду с поглощением в области 450-460 нм имеет поглощение в ультрафиолетовом диапазоне макс 337 нм, а также в области макс 592 нм. Максимум флуоресценции люмирубина расположен при макс 650 нм (возб 540 нм). Исследования показали, что в растворе,содержащем наряду с люмирубином -билирубин, а также его цис-тран-фотоизомеры,отсутствует длина волны, позволяющая произвести селективное возбуждение флуоресценции люмирубина. Как следует из фиг. 5, кривая 1 и кривая 2, регистрируемый спектр флуоресценции содержит также примесное свечение фотопродуктов. По этой причине использование люминесценции для оценки относительной концентрации люмирубина в смеси фотопродуктов (без их хроматографического разделения) требует разложения суммарного спектра на индивидуальные компоненты. В этом случае анализ может быть произведен с применением, например, широко известного метода Аленцева-Фока либо методом компьютерного моделирования. Указанная процедура значительно упрощается,поскольку спектр флуоресценции фотопродукта 2 при возб 620 нм не искажен свечением других компонент и его доля в суммарном спектре флуоресценции может быть оценена по интенсивности испускания на ее длинноволновом склоне. 11370 1 2008.12.30 Суть разработанного нами способа определения спектра флуоресценции люмирубина,(интенсивность которой пропорциональна концентрации люмирубина) в смеси фотопродуктов билирубина поясняет фиг. 6. При этом кривая 1 на фиг. 6 представляет собой спектр флуоресценции одного из фотопродуктов (2) в облучаемой смеси при его возбуж 2) дении (возб 6205 нм. Общая интенсивность 2 флуоресценции в диапазоне 635-800 нм пропорциональна площади под указанной кривой, то есть 2 ность флуоресценции люмирубина непосредственно не может быть измерена, так как отсутствует длина волны, обеспечивающая его селективное возбуждение. При возбуждении,1) при (возб 54010 нм, наблюдается суммарная флуоресценция двух фотопродуктов смеси (1 и 2), один из которых (1) является люмирубином. Суммарная интенсивностьфлуоресценции в диапазоне 560-800 нм пропорциональна площади под указанной кривой,то есть Для определения вклада люмирубина в суммарный спектр флуоресценции примем во 1) внимание, что в диапазоне 750 нм спектр флуоресценции как при (возб 54010 нм,2) так и (возб 6205 нм сформированы одним и тем же веществом (2) и должны совпадать. Кривая 1 на фиг. 6 представляет собой спектр флуоресценции фотопродукта 2 в спек 1) тральном диапазоне 635-800 нм при возбуждении флуоресценции (возб 54010 нм. Указанный спектр получен на основании измерения спектра флуоресценции при возбуж 2) дении (возб 6205 нм с последующим нормированием указанного спектра до величины, обеспечивающей его совмещение в диапазоне 750-800 нм с указанным участком 1) спектра флуоресценции смеси при ее возбуждении при (возб 54010 нм. Таким образом, согласно данным, представленным на фиг. 6, известна суммарная(кривая 2) двух фотопродуктов смеси (1 и 2), один из которых (1) является люмирубином, и интенсивность флуоресценции( ) 2(кривая 1) одного из фотопродуктов (2) при тех же условиях возбуждения. Отсюда следует, что интенсивность (лр) флуоресценции люмирубина (фотопродукта 1) является разностью этих величинлр . На фиг. 6 спектру флуоресценции 2 люмирубина соответствует кривая 3. При этом общая интенсивность флуоресценции люмирубина лр в диапазоне 560-800 нм пропорциональна площади под указанной кривой. Определение абсолютной концентрации люмирубина производится по формуле(эт /эт ) . 2 где- определяемая концентрация люмирубина эт - концентрация эталонного раствора люмирубина известной концентрацииэт в диапазоне 560-800 нм эталонного раствора люмирубина при длине волны возбуждения 1) 11370 1 2008.12.30 Определение относительной концентрации (Сотн) люмирубина в смеси производится по формулеотн ,2 где- коэффициент пропорциональности, характеризующий измерительную флуоресцентную установку. Примечательно, что для определения относительной концентрации люмирубина, например с целью изучения его образования при различных условиях облучения растворов билирубин-альбумин, не требуется использования эталонных растворов. Как показали проведенные измерения с использованием предложенного способа, концентрация люмирубина, образующегося при облучении ,-билирубина Х в составе его комплекса с альбумином, не зависит от концентрации кислорода в облучаемой смеси. Действительно, при воздействии излучения на комплексы билирубина с альбумином в присутствие кислорода дополнительно (по сравнению с обескислороженными условиями) образуются продукты фотоокисления билирубина, которые практически не флуоресцируют и не могут исказить результаты определения концентрации люмирубина, основанные на флуоресцентном методе. Полученный результат (независимость выхода люмирубина от концентрации кислорода в облучаемой смеси) соответствует данным, основанным на использовании хроматографических методов определения люмирубина. Для сравнения отметим, что при использовании способа, суть которого изложена в прототипе 2, выход люмирубина выше в кислородсодержащих условиях, что не соответствует данным других методов. В отличие от прототипа заявляемый способ применим также для определения концентрации люмирубина как в условиях низких, так и высоких доз воздействующего излучения. Необходимое условие, которое должно соблюдаться при проведении флуоресцентных исследований, состоит в том, что на длине волны возбуждения и регистрации флуоресценции оптическая плотность раствора не должна превышать А 0,10-0,15, что обеспечит наличие линейной зависимости между концентрацией люмирубина и интенсивностью его флуоресценции. В случае, если оптическая плотность раствора превышает указанное значение, для записи спектров могут использоваться кюветы с меньшей базой или разбавленные растворы. Таким образом, разработанный способ позволяет определить как относительную, так и абсолютную концентрацию люмирубина (циклобилирубина) в смеси фотопродуктов билирубина, содержащей люмирубин, нативный ,-билирубини его геометрические изомеры, включая ,-билирубин , Е,-билирубин , ,-билирубин , а также биливердин и продукты фотоокисления ,-билирубинабез разделения компонент по фракциям. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.