{[(22R,23R,24R)-2(,3(,22,23-Тетрагидрокси-24-метил-5(-холест-6-илиденамино]окси}уксусная кислота в качестве гаптена в синтезе конъюгата 24-эпикастастерона с бычьим сывороточным альбумином

(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Хрипач Владимир Александрович Свиридов Олег Васильевич Литвиновская Раиса Павловна Прядко Андрей Георгиевич Драч Светлана Васильевна Жабинский Владимир Николаевич Завадская Маргарита Ивановна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси 2 в качестве гаптена для получения иммуногена - конъюгата 24-эпикастастерона с бычьим сывороточным альбумином. Изобретение относится к области биоорганической химии, а именно новому химическому соединению - (22,23,24)-2,3,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5-холест-6 илиденаминооксиуксусной кислоты (далее 6-О-карбоксиметилоксим 24-эпикастастерона) формулы 1 которое может быть использовано в качестве гаптена в синтезе иммуногена - конъюгата 24-эпикастастерона с бычьим сывороточным альбумином для получения антител, специфичных к 24-метилбрассиностероидам. Брассиностероиды - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которые являются гормонами растений 1. Они присутствуют во всех растительных объектах и обладают ростмодулирующим и адаптогенным действием. Содержание брассиностероидов в растениях очень низко 10-5-10-9 и менее. В очень малых концентрациях они проявляют и свое биологическое действие. Установлено, например, что при обработке различных сельскохозяйственных культур в дозах 5-20 мг на гектар посевов наблюдается заметный ростстимулирующий и адаптогенный эффект, приводящий к увеличению урожая, повышению качества продукции и устойчивости растений к неблагоприятным условиям и болезням 27. Эти свойства брассиностероидов делают их привлекательными в качестве основы для агропрепаратов. Одним из наиболее известных в настоящее время является препарат ЭПИН, действующим веществом которого стал фитогормон 24-эпибрассинолид. Все вышеизложенное ставит на повестку дня разработку методов анализа 24-эпибрассинолида и его химического и биохимического предшественника 24-эпикастастерона (далее 24-метилбрассиностероиды). В качестве такого метода предложен метод иммуноферментного определения 24-метилбрассиностероидов, который, прежде всего, требует наличия соответствующего иммуногена. Брассиностероиды сами по себе не обладают иммуногенностью, поэтому для получения иммунного ответа у животных они могут быть использованы для иммунизации в виде конъюгатов с белками, которые, в свою очередь,могут быть получены через соответствующие гаптены. В настоящее время неизвестны гаптены на основе 24-эпикастастерона или 24-эпибрассинолида. Наиболее близок к заявляемому гаптен на основе кастастерона (24-эпимер заявляемого соединения) формулы 2 который предложен авторами для получения конъюгата с белком для выработки антител,использованных в радиоиммуноанализе брассиностероидов 8. Однако синтезированный таким образом конъюгат, во-первых, отличается структурой боковой цепи стероидной мо 2 10120 1 2007.12.30 лекулы, имеющей принципиальное значение для проявления физиологического эффекта,и, во-вторых, не позволил получить антитела, специфичные даже к группе 24-метилбрассиностероидов, для анализа которых он был предназначен. Известен также гаптен брассинолида формулы 3 который представляет собой эфир янтарной кислоты по С 3-гидроксильной группе брассинолида 9. Синтезированный на его основе конъюгат также не позволил получить антитела, специфичные к исходным 24-метилбрассиностероидам. Кроме того, наличие в молекуле лабильной сложноэфирной связи между молекулой стероида и остатком янтарной кислоты делает конъюгат на его основе нестабильным 9. Неизвестны гаптены и, следовательно, иммуногены на основе 24-метилбрассиностероидов. Задачей настоящего изобретения является (22,23,24)-2,3,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5-холест-6-илиденаминоокси уксусная кислота в качестве гаптена для получения иммуногена (конъюгата 24-эпикастастерона с бычьим сывороточным альбумином). Поставленная задача решается заявляемым соединением в качестве гаптена, который получают по описанному для производных тестостерона методу 11 взаимодействием 24 эпикастастерона с гидрохлоридом О-карбоксиметилгидроксиламина в водном пиридине,выделением и очисткой полученного соединения хроматографией на силикагеле. Пример 1. К раствору 0.1 г (0.2 ммоль) 24-эпикастастерона в 3 мл пиридина добавляют раствор 0.085 г гидрохлорида О-карбоксиметилгидроксиламина в 1 мл воды. Реакционную смесь кипятят в течение 6 ч, затем вливают в воду, экстрагируют хлороформом, экстракт сушат над 24. Хроматографируют на силикагеле смесью этилацетат-метанол 101. Получают 0.095 г (86 ) 6-О-карбоксиметилоксим 24-эпикастастерона (1).(КВ) 3460, 2950, 2880, 1720, 1645, 1470, 1450, 1395, 1220, 1110. Синтезированный гаптен используют для получения конъюгата 24-эпикастастерона с бычьим сывороточным альбумином, что подтверждается примером конкретного выполнения. 10120 1 2007.12.30 Пример 2. Растворяют 0.11 г (0.21 ммоль) (22,23,24)-2,3,22,23-тетрагидрокси-24-метил 5-холест-6-илиденаминооксиуксусной кислоты и 0.019 г (0.165 ммоль) -оксисукцинимида в 2 мл абсолютного диоксана, охлаждают до 5 С и при перемешивании добавляют раствор 0.029 г (0.14 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 0.5 мл абсолютного диоксана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5 С и 20 ч при комнатной температуре. Выпавшую в осадок дициклогексилкарбомочевину отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растворяют в этилацетате, промывают водой, сушат безводным 24, упаривают. Выход -сукцинимидного эфира 6-О-КМО-эпикастастерон 0.105 г (92 ). Маслообразный продукт, спектр 1 Н 0.66 (с, 3 Н, 18-Ме), 0.74 (с, 3 Н,19-Ме), 0.8-1.00 (, 12 Н, 21-, 26-, 27- и 28-Ме), 2.88 (с, 4 Н, -С(О)-СН 2-СН 2-С(О, 3.063.24 (, 2 Н), 3.28-3.38 (, 2 Н), 3.78 (, 1 Н), 3.92-4.00 (, 1 Н), 4.88 (, 2 Н, 2-). ИК-спектр (пленка) 3440, 2950, 2880, 1755, 1730, 1725, 1390, 1215, 1090. Растворяют 72 мг (101.55 мкмоль) -оксисукцинимидного эфира 6-О-карбоксиметоксиламиноксима 24-эпикастастерона в 7 мл диоксана и добавляют 0.1 г (1.4 мкмоль) БСА в 7 мл 0.1 М раствора бикарбоната натрия (рН 8.3). Перемешивают в течение 20 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь подвергают диализу при 20 С против дистиллированной воды в течение 36 ч, затем против 1 суспензии активированного угля в воде 20 ч, лиофилизуют и замораживают при температуре -20 С. Содержание гаптена в конъюгате, определенное спектрофотометрически, составляет 25 моль гаптена на 1 моль белка. Полученный конъюгат используют для получения антител, специфичных к 24-метилбрассиностероидам (24-эпибрассинолид и 24-эпикастастерон), что подтверждается примером конкретного выполнения. Пример 3. Группу из десяти кроликов иммунизировали конъюгатом эпикастастерон-БСА с плотностью посадки 25 молекул стероида на 1 молекулу белка. Каждому кролику вводили подкожно в 10-15 точек спины по 1 мг конъюгата, предварительно растворенного в 0,5 мл фосфатно-буферного раствора поваренной соли (рН 7,4) и эмульгированного в равном объеме полного адъюванта Фрейнда. Интервалы между инъекциями составляли 3 недели. Иммунизацию продолжали в течение 6 месяцев, осуществляя периодический отбор проб крови из ушной вены животных. Полученные образцы сыворотки тестировали на наличие связывающей способности в отношении 24-эпикастастерона и определяли их титры и значения констант ассоциации (Ка). Титр определяли как рабочее разведение антисыворотки,обеспечивающее максимальную чувствительность тест-системы при таком связывании конъюгата, которое позволяет построить калибровочный график в диапазоне 2,5-0,2 ОЕ. Характеристики антисывороток, полученных при иммунизации животных конъюгатом 24-эпикастастерона с БСА Антисыворотка А 1 А 2 Таким образом, определение оптимального титра антисыворотки для применения в ИФА показало, что ее разбавление в 10000 (А 1) или 20000 (А 2) раз позволяет обеспечить приемлемые условия определения эпикастастерона. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5